Aktivering Av RNase h

RNase H er et allestedsnærværende enzym som nedbryter rna–strengen av EN RNA-DNA-dupleks. Det har blitt identifisert i organismer så forskjellige som virus og humane celler (Crouch Og Dirksen, 1985). Minst to klasser Av rnase H har blitt identifisert i eukaryote celler. Flere enzymer Med RNase H-aktivitet er observert i prokaryoter (Crouch Og Dirksen, 1985). Selv Om RNase H er involvert I DNA-replikasjon, kan den spille andre roller i cellen og finnes i cytoplasma, så vel som kjernen (Crum et al., 1988). Imidlertid antas konsentrasjonen av enzymet i kjernen å være større, og noe av enzymet som finnes i cytoplasmatiske preparater kan skyldes atomlekkasje.

de nøyaktige gjenkjenningselementene For RNase H er ikke kjent. Det har imidlertid vist seg at oligonukleotider MED DNA-lignende egenskaper, så kort som tetramere, kan aktivere RNase H (Donis-Keller, 1979). Endringer i sukker innflytelse rnase H aktivering som sukker modifikasjoner som resulterer I RNA-lignende oligonukleotider, f.eks 2′-fluor eller 2′-metoksy synes ikke å tjene som substrater For RNase H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). Endringer i retningen av sukker til basen kan også påvirke rnase H aktivering som α-oligonukleotider ikke er i stand til å indusere RNase H eller kan kreve parallell annealing (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). I tillegg påvirker ryggradsmodifikasjoner evnen til oligonukleotider til å aktivere RNase H. Metylfosfonater aktiverer ikke RNase H (Maher et al.(1989; Miller, 1989). I motsetning fosforotioater er gode substrater (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al.(1991; Stein Og Cheng, 1993). I tillegg har kimære molekyler blitt studert som oligonukleotider som binder TIL RNA og aktiverer RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). For eksempel, oligonukleotider består av vinger av 2 ‘ – metoksyfosfonater og en fem-base gap av deoksyoligonukleotider binde til deres mål RNA og aktivere RNase H (Furdon et al ., 1989; Quartin et al., 1989). Videre ble et enkelt ribonukleotid i en sekvens av deoksyribonukleotider vist å være tilstrekkelig til å tjene som substrat for RNase H når det er bundet til dets komplementære deoksyoligonukleotid (Eder Og Walder, 1991).At det er mulig å dra nytte av kimære oligonukleotider designet for å aktivere RNase H og ha større affinitet for DERES RNA-reseptorer og for å forbedre spesifisitet, har også blitt demonstrert (Giles Og Tidd, 1992; Monia et al., 1993). I en studie var RNase H-mediert spaltning av målutskrift mye mer selektiv når deoksyoligonukleotider bestående av metylfosfonat deoksyoligonukleotidvinger og fosfodiestergap ble sammenlignet med fulle fosfodiesteroligonukleotider (Giles and Tidd, 1992).Til Tross for informasjonen Om RNase H og demonstrasjonen om at mange oligonukleotider kan aktivere RNase H i lysat og rensede enzymanalyser, er det relativt lite kjent om rollen av strukturelle trekk i RNA-mål ved aktivering Av RNase H (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al ., 1987; Walder Og Walder (1988). Faktisk har direkte bevis på At rnase H-aktivering faktisk er virkningsmekanismen av oligonukleotider i celler, til svært nylig, manglet.Nylige studier i våre laboratorier gir ytterligere, om enn indirekte, innsikt i disse spørsmålene. ISIS 1939 er et 20 mer fosforothioat komplementært til en sekvens i 3 ‘ – uoversatt region AV ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Det hemmer ICAM produksjon i humane umbilical vein endotelceller Og Nordlige blotter viser AT ICAM-1 mRNA er raskt degradert. EN 2 ‘ – metoksyanalog AV ISIS 1939 viser høyere affinitet for rna enn fosforotioatet, er stabil i celler, men hemmer ICAM-1-proteinproduksjonen mye mindre potent enn ISIS 1939. DET er sannsynlig AT ISIS 1939 destabiliserer RNA og aktiverer RNase H. I motsetning TIL ISIS 1570, en 18-mer fosforotioat som er komplementær til oversettelse initiering kodon AV ICAM-1 melding hemmet produksjonen av proteinet, men forårsaket ingen nedbrytning AV RNA. Således hadde to oligonukleotider som er i stand Til å aktivere RNase H forskjellige effekter avhengig av stedet i mRNA der de bundet (Chiang et al., 1991). En mer direkte demonstrasjon at RNase H er sannsynligvis en nøkkelfaktor i aktiviteten til mange antisense oligonukleotid ble gitt av studier der revers-ligering PCR ble brukt til å identifisere spaltningsprodukter fra bcrabl mRNA i celler behandlet med fosforotioat oligonukleotider (Crooke et al ., 1995).

Gitt den nye rollen kimære oligonukleotider med modifikasjoner i 3′-og 5 ‘ – vinger utformet for å forbedre affinitet for målet RNA og nuklease stabilitet OG EN DNA-type gap for å tjene som et substrat For RNase H, studier fokusert på å forstå effekten av ulike modifikasjoner på effektiviteten av enzymet (s) er også av stor betydning. I en slik studie På E. coli RNase H har vi rapportert at enzymet viser minimal sekvensspesifisitet og er processiv. Når et kimært oligonukleotid med 2 ‘- modifiserte sukkerarter i vingene ble hybridisert TIL RNA, var det første spaltningsstedet nukleotid ved siden av metoksy-deoksyforbindelsen nærmest 3 ‘ – enden AV RNA-substratet. Den opprinnelige spaltningshastigheten økte etter hvert som STØRRELSEN på DNA-gapet økte og effektiviteten av enzymet var betydelig mindre mot ET RNA-mål dupleksert med et kimært antisens oligonukleotid enn et FULLT dna-type oligonukleotid (Crooke et al ., 1995).i senere studier har vi vurdert interaksjonene mellom antisense oligonukleotider med strukturerte og ustrukturerte mål, og virkningen av disse interaksjonene på RNase H mer detaljert (Lima Og Crooke, 1997). Ved hjelp av en rekke ikke-spaltbare substrater og Michaelis-Menten analyser, var vi i stand til å evaluere både binding og spaltning. Vi viste at E. coli RNase H1 faktisk er et dobbeltstrenget RNA-bindende protein. Kd for RNA-dupleks var 1.6 µ; Kd for EN DNA-dupleks var 176 µ; Og Kd for enkeltstrenget DNA var 942 µ. I motsetning til dette kunne enzymet bare spalte RNA i EN RNA-DNA-dupleks. Enhver 2 ‘- modifikasjon i antisensemiddelet ved spaltningsstedet hemmet spaltning, men signifikant ladningsreduksjon og 2 ‘ – modifikasjoner ble tolerert på bindingsstedet. 2 ‘ – propoksyamin) i antisensmedikamentet redusert affinitet og spaltning. Vi har også undersøkt effekten av antisens oligonukleotidinducerte rna-strukturer på aktiviteten Til E. coli RNase H1 (Lima Og Crooke, 1997). Enhver struktur i duplekssubstratet ble funnet å ha en signifikant negativ effekt på spaltningshastigheten. Videre ble spaltning av utvalgte steder hemmet helt, og dette ble forklart av sterisk hindring pålagt AV RNA-sløyfen som krysser enten de mindre eller store sporene eller heteroduplexen. Nylig har vi klonet og uttrykt menneskelig RNase H1. Proteinet er homologt Til E. coli RNase H1, men har egenskaper som ligner de som er beskrevet for human RNase h Type 2 (Frank Et al., 1994; Wu et al., 1998). Enzymet stimuleres av lave konsentrasjoner Av Mg2+, hemmet av høyere konsentrasjoner, Og hemmes Av Mn2+ i nærvær Av Mg2+. Det er 33 kDa i molekylvekt. Det er dobbeltstrenget RNA-bindende protein og viser unike posisjons-og sekvenspreferanser for spaltning (Wu et al., 1999). I tillegg har human RNase H2 blitt klonet, men til dags dato har det uttrykte proteinet ikke vist seg å være aktivt (Frank Et al., 1998). Svært nylig har vi rapportert om effekten av flere mutasjoner introdusert i human RNase H1 på enzymets aktivitet (Wu et al., 2000). Dermed har vi nå de nødvendige verktøyene for å begynne å utforske rollene til menneskelig RNase H i biologiske Og farmakologiske prosesser og å begynne å utvikle stoffer designet for å samhandle med dem mer effektivt.Endelig, i det minste Med Hensyn Til rnase H-indusert nedbrytning av målrettet RNA, har vi nylig vist at i området 1-150 kopier AV RNA per celle har nivået av mål-RNA ingen effekt på styrken av antisenshemmere (Miraglia, 2000). Dette skyldes det faktum at antall molekyler antisensmedikament per celle overstiger antall kopier AV RNA med flere størrelsesordener. Dermed må andre faktorer være hastighetsbegrensende.