Aptamers har dukket opp som en ny kategori innen bioreceptorer på grunn av deres brede applikasjoner som spenner fra biosensing til terapi. Flere varianter av screeningsprosessen, KALT SELEX, har blitt rapportert som kan gi sekvenser med ønskede egenskaper som trengs for deres endelige bruk.

Generering av enkeltstrenget oligonukleotid libraryEdit

DET FØRSTE trinnet I SELEX innebærer syntese av helt eller delvis randomiserte oligonukleotidsekvenser av en viss lengde flankert av definerte regioner som tillater PCR-forsterkning av de randomiserte regionene og, i TILFELLE AV RNA SELEX, in vitro transkripsjon av den randomiserte sekvensen. Mens Ellington og Szostak viste at kjemisk syntese er i stand til å generere ~1015 unike sekvenser for oligonukleotidbiblioteker i deres 1990-papir om in vitro-utvalg, fant de at forsterkning av disse syntetiserte oligonukleotidene førte til betydelig tap av bassengdiversitet på GRUNN AV PCR-bias og feil i syntetiserte fragmenter. Oligonukleotidpoolen forsterkes og en tilstrekkelig mengde av det opprinnelige biblioteket legges til reaksjonen slik at det er mange kopier av hver enkelt sekvens for å minimere tapet av potensielle bindingssekvenser på grunn av stokastiske hendelser. Før biblioteket blir introdusert for å målrette for inkubasjon og selektiv oppbevaring, må sekvensbiblioteket konverteres til enkeltstrengede oligonukleotider for å oppnå strukturelle konformasjoner med målbindingsegenskaper.

Target incubationed

Umiddelbart Før målinnføring blir det enkeltstrengede oligonukleotidbiblioteket ofte oppvarmet og avkjølt sakte til renatur oligonukleotider til termodynamisk stabile sekundære og tertiære strukturer. Når det er forberedt, inkuberes det randomiserte biblioteket med immobilisert mål for å tillate oligonukleotid-målbinding. Det er flere hensyn for dette målet inkubasjonstrinnet, inkludert målet immobilisering metoden og strategier for påfølgende ubundet oligonukleotid separasjon, inkubasjonstid og temperatur, inkubasjon bufferforhold, og målet versus oligonukleotid konsentrasjoner. Eksempler på målet immobilisering metoder inkluderer affinitet kromatografi kolonner, nitrocellulose bindende analyse filtre, og paramagnetiske perler. NYLIG HAR SELEXREAKSJONER blitt utviklet der målet er hele celler, som utvides nær fullstendig sammenløp og inkuberes med oligonukleotidbiblioteket på kulturplater. Inkubasjonsbufferbetingelsene endres basert på det tiltenkte målet og ønsket funksjon av den valgte aptameren. For eksempel, i tilfelle av negativt ladede små molekyler og proteiner, brukes høye saltbuffere til ladningsscreening for å tillate nukleotider å nærme seg målet og øke sjansen for en bestemt bindingshendelse. Alternativt, hvis den ønskede aptamerfunksjonen er in vivo-protein eller helcellebinding for potensiell terapeutisk eller diagnostisk bruk, er inkubasjonsbufferforhold som ligner på in vivo plasmakonsentrasjoner og homeostatiske temperaturer mer sannsynlig å generere aptamere som kan binde in vivo. En annen vurdering i inkubasjonsbufferforhold er ikke-spesifikke konkurrenter. Hvis det er høy sannsynlighet for ikke-spesifikk oligonukleotidretensjon i reaksjonsbetingelsene, kan ikke-spesifikke konkurrenter, som er små molekyler eller polymerer annet enn SELEX-biblioteket som har lignende fysiske egenskaper til bibliotekets oligonukleotider, brukes til å okkupere disse ikke-spesifikke bindingsstedene. Varierende den relative konsentrasjonen av mål og oligonukleotider kan også påvirke egenskapene til de valgte aptamerer. Hvis en god bindingsaffinitet for den valgte aptamer ikke er en bekymring, kan et overskudd av mål brukes til å øke sannsynligheten for at minst noen sekvenser vil binde under inkubasjon og beholdes. Dette gir imidlertid ikke noe selektivt trykk for høy bindingsaffinitet, noe som krever at oligonukleotidbiblioteket er i overkant, slik at det er konkurranse mellom unike sekvenser for tilgjengelige spesifikke bindingssteder.

bindingssekvens eluering og amplifikasjonrediger

når oligonukleotidbiblioteket har blitt inkubert med målet i tilstrekkelig tid, vaskes ubundne oligonukleotider bort fra immobilisert mål, ofte ved bruk av inkubasjonsbuff slik at spesifikt bundne oligonukleotider beholdes. Med ubundne sekvenser vasket bort, blir de spesifikt bundne sekvensene eluert ved å skape denatureringsbetingelser som fremmer oligonukleotidutfolding eller tap av bindingskonformasjon, inkludert strømmer i deionisert vann, ved bruk av denatureringsløsninger som inneholder urea og EDTA, eller ved å påføre høy varme og fysisk kraft. Ved eluering av bundne sekvenser blir de beholdte oligonukleotidene omvendt transkribert TIL DNA i tilfelle RNA eller modifiserte basevalg, eller bare samlet for forsterkning i TILFELLE DNA SELEX. DISSE DNA-malene fra eluerte sekvenser forsterkes deretter VIA PCR og omdannes til enkeltstrenget DNA, RNA eller modifiserte baseoligonukleotider, som brukes som den første inngangen til neste runde av utvalg.

Oppnåelse av ssDNAEdit

EN AV DE mest kritiske trinnene I selex-prosedyren er å skaffe enkeltstrenget DNA (ssDNA) etter PCR-forsterkningstrinnet. DETTE vil tjene som input for neste syklus, så det er av avgjørende betydning at ALT DNA er enkeltstrenget og så lite SOM mulig går tapt. På grunn av den relative enkelheten bruker en av de mest brukte metodene biotinylerte reverse primere i forsterkningstrinnet, hvoretter de komplementære trådene kan bindes til en harpiks etterfulgt av eluering av den andre strengen med lut. En annen METODE er asymmetrisk PCR, hvor forsterkningstrinnet utføres med et overskudd av fremoverprimer og svært lite omvendt primer, noe som fører til produksjon av mer av den ønskede strengen. En ulempe ved denne metoden er at produktet skal renses fra dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og annet gjenværende materiale fra PCR-reaksjonen. Enzymatisk nedbrytning av den uønskede strengen kan utføres ved å merke denne strengen ved hjelp av en fosfatprobet primer, som den gjenkjennes av enzymer som Lambda-eksonuklease. Disse enzymene deretter selektivt degradere fosfat merket tråd forlater komplementær tråd intakt. Alle disse metodene gjenoppretter omtrent 50 til 70% AV DNA. For en detaljert sammenligning se artikkelen Av Svobodová et al. hvor disse og andre metoder er eksperimentelt sammenlignet. I klassisk SELEX gjentas prosessen med randomisert enkeltstrenget biblioteksgenerering, målinkubasjon og bindingssekvenseluering og forsterkning beskrevet ovenfor til det store flertallet av det beholdte bassenget består av målbindingssekvenser, selv om det er modifikasjoner og tillegg til prosedyren som ofte brukes, som diskuteres nedenfor.

Negativ eller motvalg

for å øke spesifisiteten til aptamere valgt av EN GITT SELEX-prosedyre, kan et negativt utvalg eller motvalg legges til før eller umiddelbart etter målinkubasjon. For å eliminere sekvenser med affinitet for mål immobilisering matrix komponenter fra bassenget, kan negativ seleksjon brukes der biblioteket er inkubert med mål immobilisering matrix komponenter og ubundne sekvenser beholdes. Negativ seleksjon kan også brukes til å eliminere sekvenser som binder mållignende molekyler eller celler ved å inkubere oligonukleotidbiblioteket med små molekylmålanaloger, uønskede celletyper eller ikke-målproteiner og beholde de ubundne sekvensene.

Sporingsvalgsprogresjonrediger

for å spore fremdriften AV EN SELEXREAKSJON kan antall målbundne molekyler, som tilsvarer antall oligonukleotider eluert, sammenlignes med den estimerte totale input av oligonukleotider etter eluering i hver runde. Antallet eluerte oligonukleotider kan estimeres gjennom elusjonskonsentrasjonsestimeringer via 260 nm bølgelengdeabsorbans eller fluorescerende merking av oligonukleotider. Når SELEX-reaksjonen nærmer seg fullføring, nærmer brøkdelen av oligonukleotidbiblioteket som binder målet 100%, slik at antall eluerte molekyler nærmer seg det totale oligonukleotidinngangsestimatet, men kan konvergere ved et lavere antall.

Advarsler og betraktningerrediger

NOEN SELEX-reaksjoner kan generere prober som er avhengige av primerbindingsområder for dannelse av sekundære strukturer. Det er aptamer-applikasjoner for hvilke en kort sekvens, og dermed primeravkorting, er ønskelig. En fremgang på den opprinnelige metoden tillater ET RNA-bibliotek å utelate de konstante primerområdene, noe som kan være vanskelig å fjerne etter utvelgelsesprosessen fordi de stabiliserer sekundære strukturer som er ustabile når de dannes av den tilfeldige regionen alene.