Verordening van Cardiale Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ – Opname door het Phospholamban

In het begin van de jaren 1970, een ontdekking werd gerapporteerd door Arnold Katz (Tada et al1 ), die aantoonde dat de fosforylering van geïsoleerde cardiale sarcoplasmic reticulum membranen zich vooral op een laag moleculair gewicht eiwitten. Dit fosfoproteïne werd phospholamban genoemd, naar de Griekse wortelwoorden die “fosfaat ontvangen” betekenen.”1 Phospholamban is een klein eiwit, bestaande uit 52 aminozuurresiduen,en het is aanwezig in cardiale, gladde en trage skeletspieren. De regulerende effecten ervan zijn echter voornamelijk bestudeerd in de hartspier. Uit In vitro studies is gebleken dat fosfolamban op drie verschillende plaatsen gefosforyleerd kan worden door verschillende proteïnekinasen: serine 10, door proteïnekinase C; serine 16, door cAMP – of cGMP-afhankelijk proteïnekinase; en threonine 17, door Ca2+-calmoduline–afhankelijk proteïnekinase.Elke fosforylering wordt geassocieerd met stimulatie van de beginsnelheden van Ca2+ – opname van het cardiale sarcoplasmatische reticulum, die hoofdzakelijk bij lage wordt uitgesproken , resulterend in een algemene verhoging van de affiniteit van de Ca2+ – pomp voor Ca2+.Op basis van deze waarnemingen werd aanvankelijk verondersteld dat gefosforyleerd fosfolamban functioneert als een stimulator van het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2) enzym. Aan het eind van de jaren tachtig deed zich echter een significante doorbraak voor die aantoonde dat gedefosforylleerd fosfolamban eigenlijk een remmer is van het Ca2+-transport van het cardiale sarcoplasmatisch reticulum voor Ca2+ en dat fosforylering dit remmende effect verlicht, waardoor fosforylatie-geïnduceerde stimulatie optreedt.6 Deze bevinding,samen met de identificatie van een cardiale sarcoplasmatische reticulum–geassocieerde eiwitfosfatase die fosfolamban kan dephosphoryleren, 7 heeft geleid tot ons huidige begrip van fosfolamban als een reversibele remmer van de cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ ATPase activiteit.

Fosfolamban wordt ook in situ gefosforyleerd tijdens β-adrenerge stimulatie. Studies met intacte kloppende harten of geïsoleerde cardiale myocyten hebben aangetoond dat zowel serine 16 als threonine 17 in fosfolamban gefosforyleerd worden tijdens isoproterenolstimulatie.Er werd gesuggereerd dat fosforylering van fosfolamban en de daarmee gepaard gaande verhogingen van de opnamesnelheden van het cardiale sarcoplasmatisch reticulum Ca2+ ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk waren voor de stimulerende effecten van β-agonisten in het zoogdierenhart.

structurele kenmerken van Fosfolamban

de structuur van fosfolamban is momenteel niet bekend, maar op basis van de aminozuursequentie zijn verschillende modellen voorgesteld. Algemeen wordt aangenomen dat er twee belangrijke domeinen zijn: een hydrofiele domein (AA 1-30, die aminozuurresidu ‘ s 1 tot 30 aangeven), dat de drie phosphorylation plaatsen, en een hydrophobic domein (AA 31-52) bevat, dat in het hart sarcoplasmic reticulummembraan wordt verankerd. Een deel van het hydrofiele domein is voorgesteld om in een spiraalvormige configuratie te zijn, en phosphorylation van phospholamban kan deze structurele configuratie ontspannen of verstoren.Bewijs uit verschillende laboratoria wees op het belang van het hydrofiele domein bij het bemiddelen van de regulerende effecten van fosfolamban op de cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ pomp.6111213 eigenlijk, zijn AA 2-18 in phospholamban voorgesteld om met AA 336-412 en 467-762 in SERCA2 voor functionele wijziging te interageren.14

het hydrofobe domein van fosfolamban is ook voorgesteld om een spiraalvormige structuur te hebben. Er is momenteel geen duidelijk bewijs dat dit domein interageert met de cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ pomp, hoewel verscheidene studies hebben gesuggereerd dat het hydrofobe gedeelte van phospholamban ook belangrijk is in het bemiddelen van de regelgevende gevolgen.1215 cysteïneresiduen in het α-spiraalvormige transmembraandomein zorgen voor een niet-kovalente interactie tussen monomere vormen en dragen bij tot de stabilisatie van een pentamerische structuur voor fosfolamban.16 analyse van fosfolambaanse pentameren gaf aan dat pentamervorming die was van een linkshandige spiraalvormige spiraalvormige bundel, met een cilindrische ionenporiën.17 Recent bewijs toonde aan dat een leucine-Ritssluiting de fosfolamban pentameric associatie stabiliseert en een centrale ionenporiën vormt,18 die Ca2+ – selectieve ionenoverdracht mogelijk kan maken.Het is momenteel echter niet duidelijk of pentameric assemblage essentieel is voor de functionele regulatie van het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ ATPase. Expressiestudies in celvrije systemen hebben aangetoond dat de monomere en pentamerische vormen van fosfolamban even effectief zijn in het bemiddelen van de regulerende effecten op de Ca2+ pomp.

een andere theorie over fosfolamban–Ca2+-ATPase interactie suggereerde een dimere associatie van de Ca2+ pompeiwitten rond een fosfolamban pentamer.Dit model, gebaseerd op tijd-opgelost fosforescentie anisotropie, beschreef een preferentiële interactie tussen de Ca2+-vrije pomp en gedefosforyleerd fosfolamban. Fosfolambaanse fosforylering destabiliseerde de interactie en resulteerde in een verhoogde rotatiemobiliteit van de Ca2+-ATPase in het cardiale sarcoplasmatische reticulummembraan.20

regulatie van de basale myocardiale contractiliteit door Fosfolamban

de rol van fosfolamban in de regulatie van de basale myocardiale contractiliteit is onlangs opgehelderd door de ontwikkeling van een fosfolamban-deficiënte muis.21 deze muizen, die gebruikend gen-richtingsmethodologie in muriene embryonale stamcellen worden gecreeerd, toonden hyperdynamische hartfunctie, met inbegrip van verhoogde systolische functie,verhoogde tarieven van linker ventrikelontspanning, 21 en het verbeterde ventrikelvulling.Hart met een Fosfolambandeficiëntie ontspande niet alleen sneller dan Hart met een wild-type, maar vertoonde ook verbeterde inotrope parameters, waaronder verhoogde drukontwikkeling, die werden beoordeeld in werkpreparaties21 en in vivo met behulp van echocardiografische analyses.Deze bevindingen werden onderbouwd door in vitro analyses van geïsoleerde ventriculaire cardiomyocyten uit fosfolamban-deficiënte harten, die ook een verhoging van de snelheid van relengthening, verkorting en Ca2+ kinetiek vertoonden.De verhoogde contractiele parameters weerspiegelden subcellulaire veranderingen op het cardiale sarcoplasmatische reticulum niveau. De affiniteit van de Ca2+ pomp voor Ca2+ was significant verhoogd, en dit werd geassocieerd met een verhoogd intraluminaal cardiaal sarcoplasmatisch reticulum Ca2+ gehalte in de fosfolamban-deficiënte harten in vergelijking met wild-type harten.

het functionele belang van fosfolamban voor de regulatie van cardiale contractiliteit is verder aangetoond in studies met fosfolamban heterozygote muizen, die slechts één op fosfolamban gericht allel bevatten.De harten van deze muizen drukken 40% uit van de fosfolamban niveaus aanwezig in wild-type muizenharten, en deze verminderde fosfolamban expressie wordt geassocieerd met een toename van de affiniteit van het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ transportsysteem voor Ca2+ en een toename van contractiele parameters. Het is interessant op te merken dat wanneer de niveaus van fosfolamban in het wild-type, fosfolamban-heterozygote, en fosfolamban-deficiënte harten werden uitgezet tegen de mate van samentrekking en ontspanning voor deze harten, er een nauwe lineaire correlatie werd waargenomen (Fig.1), wat wijst op een prominente rol voor fosfolamban in de regulatie van de basale contractiele parameters in het zoogdierenhart. Aangezien de niveaus van het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ ATPase niet werden beïnvloed in deze genetisch veranderde harten 25, wijzen deze gegevens er bovendien op dat veranderingen in fosfolambanspiegels,die veranderingen in de relatieve stoichiometrie van fosfolamban tot het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ ATPase kunnen weerspiegelen, geassocieerd zijn met parallelle veranderingen in cardiale contractiele parameters. De functionele stoichiometrie van fosfolamban voor het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ ATPase is momenteel echter niet bekend. In vitro studies hebben waarden gemeld variërend tussen 1: 5 en 5:1 Voor fosfolamban / SERCA2. In vivo studies met transgene muizen, die fosfolamban specifiek in het hart overexpressie, suggereerden dat de “functionele stoichiometrie” van fosfolamban/SERCA2 minder is dan 1:1 in inheemse cardiale sarcoplasmatische reticulummembranen.Het fosfolamban-eiwitgehalte in de harten van deze transgene muizen was twee keer hoger in vergelijking met wild-type harten, en de verhoogde fosfolamban-expressie resulteerde in een verhoogde remming van de Ca2+ – ATPase-affiniteit voor Ca2+, zonder enig effect op de Vmax van dit enzym.26 Bovendien, wanneer de relatieve niveaus van phospholamban om de cardiale sarcoplasmic reticulum Ca2+ – ATPase werden uitgezet tegen de EC50-waarden van de Ca2+-ATPase voor Ca2+ in het phospholamban overexpressie, wild-type, phospholamban-heterozygoot zijn, en phospholamban-deficiënte hart, er was een goede lineaire correlatie waargenomen (Fig 2), wat aangeeft dat de overexpressed phospholamban in de transgene hart was functioneel gekoppeld aan de Ca2+-ATPase. De verminderde affiniteit van de Ca2 + – ATPase voor Ca2 + in de fosfolambaanse overexpressieharten werd geassocieerd met afname van de contractiele parameters en depressie van de Ca2+ transiënten in geïsoleerde hart myocyten in vergelijking met myocyten uit wild-type harten.26 echocardiografische analyses van harten van deze transgene muizen toonden significant onderdrukte fractionele verkorting en circumferentiële verkorting in vergelijking met harten van wild-type muizen.Deze onderzoeken bij genetisch gewijzigde muizen tezamen wijzen erop dat fosfolamban een krachtige onderdrukker is van zowel contractie-als relaxatieparameters in het hart van zoogdieren.

de rol van Fosfolamban in myocardiale β-adrenerge respons

Studies in geïsoleerde kloppende harten en cardiale myocyten hebben aangetoond dat toediening van catecholamine resulteert in fosforylering van fosfolamban in cardiaal sarcoplasmatisch reticulum, fosfolemman in sarcolemmale membranen en troponine I-en C-eiwit in myofibrillen. De frequentie van fosforylering / dephosphoryleringsreacties op fosfolamban lijkt echter sneller te zijn dan die van de andere fosfoproteïnen, en fosfolamban wordt verondersteld een prominente mediator te zijn van de β-adrenerge reacties in het zoogdierhart. Fosforylering van fosfolamban gaat, als reactie op verhogingen van cAMP-spiegels tijdens toediening van β-agonist, gepaard met verhogingen van de activiteit van het cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ transportsysteem en verhoogde tarieven van cardiale ontspanning.272829 de verhoogde mate van Ca2+ opname leidt tot verhoogde cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2 + sequestratie niveaus, die beschikbaar zijn voor volgende contracties, wat leidt tot verhoogde contractiele kracht. Fosfolamban wordt echter niet alleen gefosforyleerd door cAMP-afhankelijk eiwitkinase op serine 16, maar ook door Ca2+-calmoduline eiwitkinase op threonine 17,89 en de relatieve bijdrage van elke fosforylering aan de inotrope en lusitropische effecten van β-agonisten is momenteel niet bekend.

de functionele rol van fosfolamban in de β-adrenerge signaalweg is onlangs opgehelderd met behulp van de fosfolamban-deficiënte muis. In vitro studies met geïsoleerde myocyten en cardiale preparaten van deze muizen wezen op een significante verzwakking van de inotrope en lusitropische effecten van isoproterenol in vergelijking met wild-type preparaten.2123 verder toonden in vivo studies met echocardiografische analyses van fosfolamban-ablated harten aan dat de β-adrenerge stimulatorische effecten ook werden verminderd bij het intacte dier.Hoewel fosfolamban niet het enige eiwit is dat betrokken is bij de transductie van cardiale β-adrenerge signalen, wijst het experimentele bewijs tot nu toe erop dat het een belangrijk eiwit is. De functie van fosfolamban tijdens catecholamine stimulatie van het hart suggereert een rol voor dit eiwit als een intern “remmechanisme”, dat een snelle myocardiale reactie mogelijk maakt, zodat wanneer adrenaline vrijkomt bij een “gevecht of vlucht” situatie, de fosfolamban “rem” wordt verlicht, waardoor een snelle toename van de cardiale contractie en ontspanning mogelijk is.

regulatie van Fosfolamban expressie

Fosfolamban is het product van één enkel gen en is gekloond van verschillende soorten, waaronder het varken, de kip, de muis en de mens. Er is>96% homologie tussen codeergebieden van het fosfolamban-gen onder deze soorten, en er zijn tot op heden geen isovormen van fosfolamban gedetecteerd.Het fosfolamban-gen is in kaart gebracht op humaan chromosoom 6.Studies bij muizen hebben aangetoond dat fosfolamban met betrekking tot de bloedsomloop differentieel tot expressie wordt gebracht, variërend van hoge expressieniveaus in de ventriculaire spier tot intermediaire niveaus in de atriale en pulmonale myocardiale spieren en lage maar functioneel significante expressieniveaus in de gladde spieren van de aorta. Differentiële niveaus van fosfolamban expressie in ventriculaire en atriale compartimenten bleken te correleren met verschillen in de contractiele parameters van deze spieren.

Fosfolamban expressie is ook gereguleerd tijdens ontwikkeling en veroudering. Verhoogde fosfolambanexpressie tijdens de cardiale ontwikkeling is waargenomen bij muizen, kippen, ratten en konijnen.31323334 verder is gesuggereerd dat afname van fosfolambaanse fosforylering in het ouder wordende rattenhart gepaard gaat met verminderde contractiele reacties van deze harten op catecholaminestimulatie.

myocardiale fosfolambanexpressie werd ook gereguleerd door de schildklierstatus bij zowel ratten als konijnen.Tijdens hypothyreoïdie werden de fosfolamban mRNA-spiegels in het atrium en ventrikel van konijnen niet veranderd, terwijl de fosfolamban-eiwitspiegels in de harten van ratten bleken te stijgen. Deze verhoogde fosfolambanspiegels in het hart van de rat gingen gepaard met een verminderde mate van opname van Ca2+ van het cardiale sarcoplasmatische reticulum, wat overeenkomt met een verhoogde remming van de Ca2+ – pomp van het cardiale sarcoplasmatische reticulum en een verminderde contractiliteit.Er werden tegengestelde regulerende effecten waargenomen voor fosfolamban expressie tijdens hyperthyreoïdie.Hyperthyreoïdie werd geassocieerd met verlaagde spiegels van fosfolamban mRNA in de atria en ventrikels van konijnen en verlaagde spiegels van fosfolamban-eiwit in de harten van ratten. De afname van de fosfolambanspiegels werd weerspiegeld door een verhoogde mate van Ca2+ – opname van het cardiale sarcoplasmatisch reticulum, wat consistent is met de ontremming van de Ca2+ – pomp en versterking van contractiele parameters.

recente onderzoeken naar veranderingen in de genexpressie, die optreden tijdens hartfalen, toonden aan dat veranderingen in de relatieve verhouding van fosfolamban tot de SR Ca2+ ATPase een kenmerk van deze ziekte kunnen zijn.363738 er is echter enige discrepantie in de literatuur over de manier waarop de fosfolambanexpressie verandert tijdens myocardiaal falen. Sommige studies die zijn uitgevoerd bij falende harten van mensen hebben een vermindering van fosfolamban mRNA37 of fosfolamban proteïne aangetoond, 363738 terwijl andere studies geen duidelijke veranderingen in fosfolambanspiegels van falende harten van mensen hebben waargenomen.39404142 hoewel er nog steeds controverse bestaat over veranderingen in fosfolamban tijdens hartfalen, is het duidelijk dat intracellulaire veranderingen, die gepaard gaan met onderdrukking van de contractiliteit van het hart, wijzen op een rol van fosfolamban in de etiologie van de ziekte.

samenvatting

ons inzicht in de rol van fosfolamban in de cardiale fysiologie is de afgelopen twee decennia zodanig geëvolueerd dat dit eiwit nu wordt beschouwd als een kritische onderdrukker van myocardiale contractiliteit. Fosfolamban, door zijn remmende effecten op de affiniteit van de cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ pomp voor Ca2+, onderdrukt zowel de snelheid van ontspanning en samentrekking in het zoogdierhart. Deze remmende effecten kunnen worden verlicht door (1) phospholamban phosphorylation, (2) downregulation van phospholamban genexpressie, en (3) disruption of the phospholamban–Ca2+-ATPase interaction. Zo kunnen genetische benaderingen en farmacologische interventies, ontworpen om de fosfolamban remmende werking op de cardiale sarcoplasmatische reticulum Ca2+ pomp en myocardiale ontspanning te verlichten, waardevol blijken in het omkeren van de effecten van verschillende ziekten in het zoogdierhart. Dergelijke interventies kunnen worden opgezet om de fosfolambanfosfatase te remmen, de gefosforyleerde toestand van fosfolamban te stabiliseren, de fosfolamban-Ca2+-ATPase-interactie te onderbreken, de fosfolamban-transcriptie te verlagen of de mRNA-stabiliteit van fosfolamban te verstoren. Ontwikkeling van dergelijke therapeutische strategieën om fosfolamban te bereiken zal een belangrijk toekomstig doel zijn voor de klinische verbetering van de contractiliteit in het falende hart.

voetnoten