Regulacja wychwytu retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ przez Fosfolamban

we wczesnych latach 1970-tych odkrycie zostało zgłoszone przez Arnolda Katza (Tada i wsp.1), który wykazał, że fosforylacja izolowanych membran siatek sarkoplazmatycznych serca występowała głównie na białku o niskiej masie cząsteczkowej. Fosfoproteina ta została nazwana phospholamban, od greckich słów korzeniowych oznaczających ” otrzymać fosforan.”1 Fosfolamban jest małym białkiem, zawierającym 52 reszty aminokwasowe i jest obecny w mięśniach szkieletowych serca, gładkich i wolno drgających . Jednak jego działanie regulacyjne badano głównie w mięśniu sercowym. Badania in vitro wykazały, że fosfolamban może być fosforylowany w trzech różnych miejscach przez różne kinazy białkowe: serynę 10 przez kinazę białkową C; serynę 16 przez kinazę białkową cAMP lub cGMP; i treoninę 17 przez kinazę białkową zależną od Ca2+kalmoduliny.Każda fosforylacja wiąże się ze stymulacją początkowego wychwytu retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+, który jest głównie wyraźny przy niskim poziomie , co skutkuje ogólnym wzrostem powinowactwa pompy Ca2+ do Ca2+.Na podstawie tych obserwacji początkowo postawiono hipotezę, że fosforylowany fosfolamban działa jako stymulator enzymu sarkoplazmatycznego retikulum Ca2+-ATPazy (SERCA2) serca. Jednak pod koniec lat 80. nastąpił znaczący przełom wykazujący, że defosforylowany fosfolamban jest w rzeczywistości inhibitorem transportu sercowego retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ dla Ca2+ i że fosforylacja łagodzi ten efekt hamujący, dając wygląd stymulacji indukowanej fosforylacją.6 to odkrycie, wraz z identyfikacją fosfatazy białkowej związanej z siateczką sarkoplazmatyczną, która może defosforylować fosfolamban, 7 doprowadziło do naszego obecnego zrozumienia fosfolambanu jako odwracalnego inhibitora aktywności ATPazy Ca2 + z siateczką sarkoplazmatyczną serca.

Fosfolamban jest również fosforylowany in situ podczas stymulacji β-adrenergicznej. Badania na nienaruszonych bijących sercach lub izolowanych miocytach sercowych wykazały, że zarówno seryna 16, jak i treonina 17 w fosfolambanie ulegają fosforylacji podczas stymulacji izoproterenolem.Sugerowano, że fosforylacja fosfolambanu i towarzyszący jej wzrost wychwytu retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ są przynajmniej częściowo odpowiedzialne za stymulujące działanie agonistów receptorów β w sercu ssaków.

charakterystyka strukturalna Fosfolambanu

struktura fosfolambanu nie jest obecnie znana, ale na podstawie jego sekwencji aminokwasowej zaproponowano kilka modeli. Ogólnie przyjmuje się, że istnieją dwie główne dziedziny: domena hydrofilowa (AA 1-30, wskazująca reszt aminokwasowych 1 do 30), która zawiera trzy miejsca fosforylacji, i domena hydrofobowa (AA 31-52), która jest zakotwiczona w błonie siateczki sarkoplazmatycznej serca. Sugeruje się, że część domeny hydrofilowej znajduje się w konfiguracji spiralnej, a fosforylacja fosfolambanu może rozwinąć lub zakłócić tę konfigurację strukturalną.10 dowody z kilku laboratoriów wskazywały na znaczenie domeny hydrofilowej w pośredniczeniu w regulacyjnym wpływie fosfolambanu na pompę retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ serca.6111213 w rzeczywistości zasugerowano, że AA 2-18 w fosfolambanie wchodzi w interakcje z AA 336-412 i 467-762 w SERCA2 w celu modyfikacji funkcjonalnej.14

hydrofobowa domena fosfolambanu również została zaproponowana jako struktura spiralna. Obecnie nie ma wyraźnych dowodów na to, że ta domena oddziałuje z sercową pompą retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+, chociaż kilka badań sugeruje, że hydrofobowa część fosfolambanu jest również ważna w mediacji efektów regulacyjnych.1215 pozostałości cysteiny w α-spiralnej domenie transbłonowej zapewniają niekowalencyjne interakcje między formami monomerycznymi i przyczyniają się do stabilizacji struktury pentamerycznej dla fosfolambanu.16 Analiza pentamerów fosfolambanu wykazała, że powstawanie pentameru było tworzeniem leworęcznego zwoju spiralnego z cylindrycznym porem jonów.17 ostatnie dowody wykazały,że zamek leucyny stabilizuje związek pentameryczny fosfolambanu i tworzy centralny por jonowy, 18 który może pozwolić na selektywny transfer jonów Ca2+.Nie jest jednak obecnie jasne, czy zespół pentameryczny jest niezbędny do regulacji funkcjonalnej retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ ATPazy serca. Badania ekspresji w systemach wolnych od komórek wykazały, że monomeryczne i pentameryczne formy fosfolambanu są równie skuteczne w pośredniczeniu w regulacyjnym wpływie na pompę Ca2+.14

inna teoria interakcji fosfolamban–Ca2+-Atpaza zaproponowała dimeryczny związek białek pompy Ca2+ wokół pentameru fosfolambanu.Model ten, oparty na anizotropii fosforescencji rozdzielonej w czasie, opisywał preferencyjną interakcję pomiędzy pompą wolną od Ca2+a defosforylowanym fosfolambanem. Fosforylacja fosfolambanu destabilizowała interakcję i powodowała zwiększoną ruchliwość rotacyjną Ca2+-ATPazy w błonie retikulum sarkoplazmatycznego serca.

Regulacja podstawowej kurczliwości mięśnia sercowego przez Fosfolamban

rola fosfolambanu w regulacji podstawowej kurczliwości mięśnia sercowego została niedawno wyjaśniona poprzez rozwój myszy z niedoborem fosfolambanu.Myszy te, stworzone przy użyciu metodologii ukierunkowania na geny w mysich embrionalnych komórkach macierzystych, wykazywały hiperdynamiczną czynność serca, w tym zwiększoną czynność skurczową, zwiększone tempo relaksacji lewej komory,21 i zwiększone wypełnienie komór.Serca z niedoborem Fosfolambanu nie tylko rozluźniały się szybciej niż serca typu dzikiego, ale także wykazywały zwiększone parametry inotropowe, w tym zwiększone tempo rozwoju ciśnienia, które oceniano w preparatach wykonujących pracę21 i in vivo, stosując analizy echokardiograficzne.Wyniki te zostały potwierdzone analizami in vitro izolowanych kardiomiocytów komorowych z serca z niedoborem fosfolambanu, które również wykazywały zwiększenie częstości nawracania, skracania i kinetyki Ca2+.Podwyższone parametry kurczliwości odzwierciedlały zmiany subkomórkowe na poziomie siateczki sarkoplazmatycznej serca. Powinowactwo pompy Ca2+ do Ca2+ było znacznie zwiększone, co wiązało się ze zwiększeniem zawartości retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ w sercach z niedoborem fosfolambanu w porównaniu z sercami typu dzikiego.

funkcjonalne znaczenie fosfolambanu w regulacji kurczliwości serca zostało dodatkowo potwierdzone w badaniach heterozygotycznych myszy fosfolambanowych, które zawierają tylko jeden allel ukierunkowany na fosfolamban.Serca tych myszy wyrażają 40% poziomu fosfolambanu obecnego w sercach myszy typu dzikiego, a zmniejszona ekspresja fosfolambanu jest związana ze zwiększeniem powinowactwa układu transportowego siateczki sarkoplazmatycznej Ca2+ do Ca2+ i wzrostem parametrów skurczowych. Interesujące jest, aby zauważyć, że gdy poziomy fosfolambanu w sercach typu dzikiego, heterozygotycznych i z niedoborem fosfolambanu zostały wykreślone w stosunku do szybkości skurczu i relaksacji tych serc, zaobserwowano ścisłą korelację liniową (ryc. 1), co sugeruje znaczącą rolę fosfolambanu w regulacji podstawowych parametrów skurczu w sercu ssaków. Ponadto, ponieważ w tych genetycznie zmienionych sercach nie stwierdzono wpływu na stężenie retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ ATPazy serca, 25 dane te wskazują, że zmiany stężenia fosfolambanu, które mogą odzwierciedlać zmiany w względnej stechiometrii fosfolambanu względem retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ ATPazy serca, są związane z równoległymi zmianami parametrów skurczu serca. Jednak funkcjonalna Stechiometria fosfolambanu do sercowego retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ Atpaza nie jest obecnie znana. Badania in vitro wykazały wartości wahające się od 1: 5 do 5:1 dla fosfolambanu / SERCA2. Badania In vivo z wykorzystaniem transgenicznych myszy, które nadekspresują fosfolamban konkretnie w sercu, sugerują, że” funkcjonalna Stechiometria ” fosfolambanu/SERCA2 jest mniejsza niż 1:1 w rodzimych błonach siateczkowych sarkoplazmatycznych serca.Poziom białka fosfolambanu w sercach tych transgenicznych myszy był dwukrotnie wyższy w porównaniu z sercami typu dzikiego, a zwiększona ekspresja fosfolambanu powodowała zwiększone hamowanie powinowactwa Ca2 + – ATPazy do Ca2+, bez żadnego wpływu na Vmax tego enzymu.26 Ponadto, gdy względne poziomy fosfolambanu w stosunku do sercowego retikulum sarkoplazmatycznego Ca2 + ATPazy zostały wykreślone w stosunku do wartości EC50 dla Ca2 + ATPazy w sercach z nadekspresją fosfolambanu, dzikim typem, heterozygotycznym fosfolambanem i z niedoborem fosfolambanu, zaobserwowano ścisłą korelację liniową (ryc. 2), co wskazuje, że nadekspresja fosfolambanu w sercach transgenicznych była funkcjonalnie sprzężona z Atpazą Ca2+. Zmniejszone powinowactwo ATPazy Ca2+do Ca2+ w sercach nadekspresyjnych fosfolambanu było związane ze zmniejszeniem parametrów skurczowych i zmniejszeniem stanu przejściowego Ca2+ w izolowanych miocytach serca w porównaniu z miocytami z serca typu dzikiego.Echokardiograficzne analizy serc tych transgenicznych myszy wykazały znacząco tłumione skracanie ułamkowe i obwodowe w porównaniu z sercami myszy typu dzikiego.Łącznie te badania na genetycznie zmienionych myszach wskazują, że fosfolamban jest silnym represorem zarówno parametrów skurczowych, jak i relaksacyjnych w sercu ssaków.

rola Fosfolambanu w reakcji β-adrenergicznej mięśnia sercowego

badania na izolowanych bijących sercach i miocytach serca wykazały, że podawanie katecholaminy powoduje fosforylację fosfolambanu w siateczce sarkoplazmatycznej serca, fosfolemmana w błonach sarkolemmalnych oraz troponiny I I C w miofibrylach. Jednakże, szybkość reakcji fosforylacji/defosforylacji na fosfolambanie wydaje się być szybsza niż w przypadku innych fosfoprotein, a fosfolamban jest sugerowany jako główny mediator reakcji β-adrenergicznych w sercu ssaków. Fosforylacji fosfolambanu, w odpowiedzi na zwiększenie stężenia cAMP podczas podawania β-agonisty, towarzyszy zwiększenie aktywności układu transportowego siateczki sarkoplazmatycznej Ca2+ i zwiększenie częstości relaksacji serca.272829 zwiększone wskaźniki wychwytu Ca2+ prowadzą do zwiększenia poziomów sekwestracji retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+, które są dostępne dla kolejnych skurczów, co prowadzi do zwiększenia siły skurczu. Jednakże fosfolamban jest nie tylko fosforylowany przez zależną od cAMP kinazę białkową na serynę 16, ale także przez kinazę białkową Ca2+-kalmodulinę na treoninę 17,89 i względny udział każdej fosforylacji w inotropowym i lusitropowym działaniu agonistów β nie jest obecnie znany.

funkcjonalna rola fosfolambanu w szlaku sygnalizacji β-adrenergicznej została niedawno wyjaśniona przy użyciu myszy z niedoborem fosfolambanu. Badania in vitro na wyizolowanych miocytach i preparatach sercowych od tych myszy wykazały znaczne tłumienie inotropowego i lusitropowego działania izoproterenolu w porównaniu z preparatami typu dzikiego.2123 ponadto badania In vivo z wykorzystaniem analiz echokardiograficznych serca z ablacją fosfolambanową wykazały, że działanie stymulujące β-adrenergiczne było również osłabione u nienaruszonego zwierzęcia.Tak więc, chociaż fosfolamban nie jest jedynym białkiem biorącym udział w transdukcji sygnalizacji β-adrenergicznej serca, dotychczasowe doświadczenia wskazują, że jest to główne białko. Funkcja fosfolambanu podczas stymulacji katecholaminą serca sugeruje rolę tego białka jako wewnętrznego „mechanizmu hamulcowego”, który pozwala na szybką reakcję mięśnia sercowego, tak że gdy adrenalina jest uwalniana w sytuacji” walki lub ucieczki”,” hamulec ” fosfolambanu jest łagodzony, umożliwiając szybki wzrost skurczu serca i relaksacji.

regulacja ekspresji Fosfolambanu

Fosfolamban jest produktem jednego genu i został sklonowany z kilku gatunków, w tym świni, kurczaka, myszy i człowieka. Istnieje>96% homologii między regionami kodującymi Gen fosfolambanu wśród tych gatunków i nie wykryto dotąd izoform fosfolambanu.30 gen fosfolambanu został zmapowany do ludzkiego chromosomu 6.Badania przeprowadzone na myszach wykazały, że w odniesieniu do układu krążenia fosfolamban ulega zróżnicowanej ekspresji, począwszy od wysokiego poziomu ekspresji w mięśniach komorowych, przez pośredni poziom w mięśniach przedsionkowych i płucnych mięśnia sercowego oraz do niskiego, ale funkcjonalnie znaczącego poziomu ekspresji w mięśniach gładkich aorty. Różne poziomy ekspresji fosfolambanu w komorach komorowych i przedsionkowych zdawały się korelować z różnicami w parametrach skurczowych tych mięśni.

ekspresja Fosfolambanu jest również regulowana podczas rozwoju i starzenia. U myszy, kurcząt, szczurów i królików obserwowano zwiększenie ekspresji fosfolambanu w trakcie rozwoju serca.31323334 ponadto sugerowano, że zmniejszenie fosforylacji fosfolambanu w starzejącym się sercu szczura wiąże się ze zmniejszoną reakcją kurczliwą tych serc na stymulację katecholamin.

ekspresja fosfolambanu mięśnia sercowego jest również regulowana przez stan tarczycy zarówno u szczurów, jak i u królików.3435 podczas niedoczynności tarczycy stężenie mRNA fosfolambanu nie ulegało zmianie w przedsionku i komorze królika, podczas gdy stężenie białka fosfolambanu zwiększało się w szczurzych sercach. Te podwyższone poziomy fosfolambanu w sercu szczura były związane ze zmniejszeniem częstości wychwytu retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+, zgodnie ze zwiększonym hamowaniem pompy retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ i zmniejszeniem kurczliwości serca.Podczas nadczynności tarczycy obserwowano przeciwne efekty regulacji ekspresji fosfolambanu.3435 nadczynność tarczycy była związana ze zmniejszeniem stężenia mRNA fosfolambanu w przedsionkach i komorach królików oraz zmniejszeniem stężenia białka fosfolambanu w sercach szczurów. Zmniejszenie stężenia fosfolambanu było odzwierciedlone przez zwiększenie częstości wychwytu retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+, zgodne z odhamowaniem pompy Ca2+ i poprawą parametrów skurczowych.

ostatnie badania zmian ekspresji genów, które występują podczas niewydolności serca, wykazały, że zmiany względnego stosunku fosfolambanu do ATPazy SR Ca2+ mogą być znakiem rozpoznawczym tej choroby.363738 istnieje jednak pewna rozbieżność w literaturze co do sposobu zmiany ekspresji fosfolambanu podczas niewydolności mięśnia sercowego. Niektóre badania przeprowadzone na zawodzących ludzkich sercach wykazały zmniejszenie poziomu fosfolambanu mRNA37 lub białka fosfolambanu,363738, podczas gdy inne badania nie wykazały widocznych zmian poziomu fosfolambanu w zawodzących ludzkich sercach.39404142 chociaż nadal istnieją kontrowersje w odniesieniu do zmian fosfolambanu podczas niewydolności serca, jest oczywiste, że zmiany wewnątrzkomórkowe, które są związane z tłumieniem kurczliwości serca, sugerują rolę fosfolambanu w etiologii choroby.

podsumowanie

nasze zrozumienie roli fosfolambanu w fizjologii serca ewoluowało w ciągu ostatnich dwóch dekad do punktu, w którym białko to jest obecnie uważane za krytyczny represor kurczliwości mięśnia sercowego. Fosfolamban, poprzez jego hamujący wpływ na powinowactwo sercowej retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ do Ca2+, tłumi zarówno tempo relaksacji, jak i skurczu w sercu ssaków. Te działania hamujące można złagodzić poprzez (1) fosforylację fosfolambanu, (2) obniżenie ekspresji genu fosfolambanu i (3) zakłócenie interakcji fosfolambanu–Ca2+-ATPazy. Tak więc genetyczne podejścia i interwencje farmakologiczne, mające na celu złagodzenie działania hamującego fosfolamban na pompę sarkoplazmatyczną Ca2+ i relaksację mięśnia sercowego, mogą okazać się cenne w odwracaniu skutków kilku chorób w sercu ssaków. Takie interwencje mogą być zaprojektowane w celu zahamowania fosfatazy fosfolambanu, stabilizacji fosforylowanego stanu fosfolambanu, przerwania interakcji fosfolambanu-Ca2+ – ATPazy, zmniejszenia transkrypcji fosfolambanu lub zakłócenia stabilności mRNA fosfolambanu. Opracowanie takich strategii terapeutycznych ukierunkowanych na fosfolamban będzie ważnym przyszłym celem klinicznej poprawy kurczliwości w niewydolności serca.

Przypisy