LETTER

Neisseria meningitidis może powodować potencjalnie śmiertelną chorobę układową . Wczesna diagnoza i szybka interwencja przeciwdrobnoustrojowa są kluczowe dla korzystnych wyników klinicznych. Opisywano oporność na antybiotyki na penicyliny (1), tetracykliny (2) i sulfonamidy (3), a także chinolony (4) i ryfampicynę (5).

N. meningitidis wykazuje ekspresję dwóch głównych Porin, PorA i PorB, które są zmienne antygenowo między szczepami i w obrębie szczepu, A PorA jest zmienna fazowa (przypadkowe włączanie/wyłączanie) (6). Neisseria gonorrhoeae zawiera pojedynczy por, PorB. Zmiany ekspresji porin lub wariantowych Porin pośredniczą w oporności na antybiotyki u kilku bakterii Gram-ujemnych, w tym N. gonorrhoeae (7,-10). U N. meningitidis brak PorB zwiększa oporność in vitro na tetracyklinę i cefsulodynę (11). Nie opisano roli PorA w oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe u meningokoków. Oprócz proponowanej roli w unikaniu odporności, postawiliśmy hipotezę, że ekspresja PorA zmienna fazowo może stanowić oczywisty mechanizm unikania środków przeciwdrobnoustrojowych przez meningokoki, jeśli PorA pośredniczy w wychwytywaniu lub wykluczeniu antybiotyków. Wygenerowaliśmy szczepy pozbawione PorA lub PorB i przeprowadziliśmy testy MIC. Zbadaliśmy również, czy zmieniona ekspresja PorA jest wybrana przez ekspozycję przeciwdrobnoustrojową w trakcie testu MIC.

geny porA i porB z sekwencjami flankującymi zostały amplifikowane ze szczepu N. meningitidis MC58 i sklonowane do pGEM t-easy. Odwrotna PCR, po której następuje samo ligacja, dała plazmidy z wewnętrznymi delecjami i wprowadzonymi miejscami ograniczenia. Kaseta LacZ / kanamycyna (12) została sklonowana we wprowadzonym miejscu SmaI usuniętego allelu PorA, dając plazmid pPorALacZKan. Gen acetylotransferazy chloramfenikolowej został amplifikowany i sklonowany do miejsca wprowadzonego BglII deletowanego allelu porB, w plazmidzie pPorB: CAT. Konstrukcje porA lacZ kan lub porB:: cat zostały przekształcone w szczep N. meningitidis ¢9 (13) w celu uzyskania szczepów ¢9δpora i ¢9δporb. Alleliczne zastąpienie alleli porA lub porb typu dzikiego zmutowanym allelem zostało potwierdzone przez PCR i sekwencjonowanie, a także SDS-PAGE wyekstrahowanych z Sarkozylu białek błony zewnętrznej (Fig. 1a).

Analiza ekspresji porin podczas analizy MIC. (A)białka błonowe wyizolowano przez ekstrakcję Sarkozylem, a 10 µg oddzielono na 8-12% żelach akryloamidowych bis-Tris przed barwieniem Coomassie. Lane 1, ¢9; lane 2, ¢9δpora; lane 3, ¢9δporb. B) próbki z ostatniej studzienki wykazującej zmętnienie platerowano agarem BHI i immunoblotowano specyficznym dla PorA MAB MN14C11. 6.

Mic oceniano metodą mikrodilucji bulionu w 96-studzienkowych płytkach (14), stosując bakterie hodowane przez noc na uzupełnionym agarze BHI w 37°C i subkulturalne wytrząsanie przez około 4 godziny w bulionie bhi w 37°C, przed dostosowaniem do około 5 × 105 CFU / ml w oparciu o gęstość optyczną przy 600 nm (OD600). Po dodaniu 50 µl do seryjnie rozcieńczonych antybiotyków, Mic zapisywano po nocnym wzroście w temperaturze 37°C (Tabela 1) jako stężenia, przy których nie obserwowano zmętnienia. Każdy test przeprowadzono trzy razy, za każdym razem w trzech egzemplarzach. Dla każdego leczenia Mic były identyczne w testach i między nimi.

nasze wyniki potwierdziły, że utrata ekspresji Porbów meningokokowych zwiększa oporność na tetracyklinę (11). Mutacje w PorB również przyczyniają się do oporności na tetracyklinę w N. gonorrhoeae (9, 15). Zalecana terapia skojarzona w przypadku N. gonorrhoeae opornych na wiele czynników obejmuje wstrzykiwany ceftriakson i doustną doksycyklinę lub azytromycynę (16). W tym kontekście należy zauważyć, że zmutowany szczep meningokoków ¢9δporb miał zmniejszoną wrażliwość na doksycyklinę. Zauważyliśmy zmniejszoną wrażliwość na cefalotynę na ¢9δporb, a także na cefalosporyny cefotaksym i ceftazydym. Poprzedni raport łączył mutację PorB N. meningitidis ze zwiększoną opornością na cefsulodynę (11). W N. gonorrhoeae, warianty PorB loop 3 również przyczyniają się do zwiększenia oporności na cefalosporyny (17). Nasze potwierdzenie, że Neisseria PorB moduluje wrażliwość na cefalosporynę, zwiększa możliwość, że zmniejszenie wrażliwości na tę klasę może wystąpić klinicznie lub być ułatwione przez mutacje PorB w oponach lub gonokokach.

stosowanie fluorochinolonu nie jest już zalecane w zakażeniu gonokokami (18), a mutacje punktowe PorB1b N. gonorrhoeae przyczyniają się do zmniejszenia wrażliwości N. gonorrhoeae na cyprofloksacynę. Zmiany ekspresji Porin gonokokowych zmieniają oporność na cyprofloksacynę( 19); stwierdziliśmy, że mutacja porbów meningokokowych powoduje również zmniejszoną wrażliwość na cyprofloksacynę. Z drugiej strony, szczep ten był bardziej podatny na ryfampicynę, drugi duży wybór w profilaktyce meningokoków, być może poprzez zmienioną architekturę błon, jak sugerowano w przypadku zmienionej oporności na ryfamycynę opornych na kolistynę Acinetobacter baumannii (20).

natomiast nie zaobserwowano zmian wrażliwości ¢9δpory w porównaniu do macierzystego szczepu PorA+ dla żadnego z badanych antybiotyków (Tabela 1). Sugeruje to, że PorA nie odgrywa bezpośredniej roli w wprowadzaniu środków przeciwdrobnoustrojowych do komórki lub istnieje selekcja zmniejszonej ekspresji PorA poprzez zmianę fazy podczas testu MIC, zarówno w szczepie rodzicielskim, jak i w ¢9δporb, potencjalnie maskując wejście antybiotyku za pośrednictwem PorA. Aby to ocenić, wyizolowaliśmy bakterie z odwiertu końcowego, w którym obserwowano zmętnienie i oceniliśmy ekspresję PorA przez immunoblotting Kolonii przy użyciu mysich przeciwciał monoklonalnych anty-P1.7 (MAB) MN14C11 .6 (uzyskanych z NIBSC, Wielka Brytania). Jako grupę kontrolną porównano reaktywność szczepu rodzicielskiego ¢9 i zmutowanego szczepu PorA ¢9ΔPorA. Pokazało to, że ekspresja PorA nie uległa zmianie między studzienkami kontrolnymi a po ekspozycji na którykolwiek z badanych środków przeciwdrobnoustrojowych (patrz Fig. 1B); zatem zmniejszona wrażliwość ¢9δporb nie jest spowodowana zmienionymi poziomami ekspresji PorA.

nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o roli N. meningitidis PorB w cefalosporynie i oporności na tetracykliny (9, 11, 15). Podobieństwo do gonokokowego PorB1b w odniesieniu do oporności na antybiotyki jest uderzające. Wybiórcza ekspresja PorB zmniejszyła również wrażliwość meningokoków na doksycyklinę, jedną z zalecanych terapii opornych na mnożenie N. gonorrhoeae. Co kłopotliwe, sugeruje to, że wybiórcze ciśnienie może prowadzić do pojawienia się gonokokowych odmian PorB o zmniejszonej wrażliwości na doksycyklinę. Chociaż odnotowaliśmy tylko 2-krotne różnice, które są mało prawdopodobne, aby w izolacji prowadziły do niepowodzenia leczenia, synergia wariacji PorB z innymi mutacjami może rozwinąć spektrum oporności meningokokowej i gonokokowej. Nie znaleźliśmy dowodów na rolę PorA w transferze antybakteryjnym przez błonę zewnętrzną.