aspekty metodologiczne

Streptozotocyna (2-deoksy-2-(3-metylo-3-nitrozoureido)-d-glukopiranoza), antybiotyk o działaniu przeciwnowotworowym wytwarzany przez bakterie Streptomyces achromogenes, selektywnie niszczy komórki β wysepek trzustkowych Langerhansa (Fig. 9.1).Streptozotocyna indukuje pękanie nici DNA i alkilację DNA, co prowadzi do martwicy komórek β trzustki.12,13 Streptozotocyna jest transportowana wewnątrz komórki β przez transporter glukozy GLUT2 i dlatego ekspresja GLUT2 jest wymagana do toksycznego działania.13,14 szlaki sygnałowe toksycznego działania streptozotocyny obejmują aktywację indukowanej syntazy NO, zwiększenie stężenia NO, 15 i zwiększone wytwarzanie H2O2.16

rysunek 9.1. Histologia i immunohistochemia wysepek trzustkowych Langerhansa w grupie kontrolnej (lewy panel) i szczurów cukrzycowych indukowanych streptozotocyną (prawy panel).

u szczurów z cukrzycą liczba i wielkość wysepek były zmniejszone, a immunoreaktywność insuliny była zmniejszona.

rozwój cukrzycy po zastosowaniu streptozotocyny jest bardzo szybki, zwłaszcza u szczurów. Wrażliwość komórek β na glukozę jest już znacznie zmniejszona 2 godziny po zastosowaniu streptozotocyny; zniszczenie i znaczne zmniejszenie liczby komórek β następuje w kilka godzin po zastosowaniu.Towarzyszą temu zmiany stężenia glukozy i insuliny w osoczu: 2 godziny po zastosowaniu rozwija się hiperglikemia bez zmian w poziomie insuliny w osoczu i trzustce, a następnie hipoglikemia ze zwiększonym poziomem insuliny w osoczu, ale bez zmian w poziomie insuliny trzustkowej. Jeden dzień po zastosowaniu streptozotocyny szczury wykazują wszystkie charakterystyczne objawy cukrzycy, w tym hiperglikemię, glikozurię, wielomocz oraz obniżony poziom insuliny w osoczu i trzustce.

Streptozotocyna może być stosowana w pojedynczej dawce lub w sposób powtarzany, Zwykle rozpuszczona w buforze cytrynianowym (pH 4.5), poprzez wstrzyknięcie dożylne, dootrzewnowe lub dotętnicze. W naszych doświadczeniach cukrzyca była niezawodnie indukowana przez pojedyncze dożylne wstrzyknięcie streptozotocyny rozpuszczonej w buforze cytrynianowym w żyle ogonowej, w dawce 65 mg / kg masy ciała. Dawka konieczna do indukcji cukrzycy u szczurów waha się między 40 a 60 mg/kg masy ciała, chociaż czasami podaje się wyższe wartości.Objawy cukrzycy dobrze korelują ze stosowaną dawką. Ogólnie rzecz biorąc, w dawkach poniżej 40 mg/kg masy ciała obserwuje się tylko niewielkie zmiany glikemii, glikozurii i stężenia insuliny w osoczu, a te niewielkie zmiany mają tendencję do samoistnej normalizacji u do 25% zwierząt.Po podaniu wystarczającej dawki streptozotocyny indukcja cukrzycy u szczurów jest łatwa, szybka i niezawodna. Jednak w większości badań wykorzystujących ten model szczura patogeneza cukrzycy i związane z nią objawy były badane tylko przez kilka tygodni lub miesięcy, podczas których cukrzyca jest w pełni rozwinięta i utrzymana. Długotrwałe skutki streptozotocyny i możliwe wyleczenie z cukrzycy wywołanej streptozotocyną były badane znacznie rzadziej.

w naszych eksperymentach obserwowaliśmy szczury z cukrzycą wywołaną streptozotocyną przez 1 rok, a wyzdrowienie zaobserwowano u znacznej części zwierząt. Wszystkie 152 szczury wykazały pełnowartościową cukrzycę przez pierwsze 6 miesięcy eksperymentu; w drugiej połowie roku można było wyraźnie wyróżnić dwie różne grupy. W grupie pacjentów z cukrzycą (n = 92) glikemia utrzymywała się na wysokim poziomie (> 18 mmol/l), Masa ciała nie zwiększała się, stężenie insuliny w osoczu utrzymywało się na niskim poziomie, a analiza histologiczna wykazała zmniejszenie liczby i wielkości wysepek trzustkowych z brakiem komórek wydzielających insulinę. Natomiast grupa odzysku (n = 60) wykazała znaczące różnice w drugiej połowie roku, które nie występowały w pierwszych 6 miesiącach eksperymentu: zmniejszenie glikemii (< 12 mmol/l), stałe zwiększenie masy ciała i zwiększenie stężenia insuliny w osoczu, zbliżone do wartości stwierdzanych u zwierząt kontrolnych. Ponadto struktura histologiczna wysepek trzustkowych była podobna do tej u zwierząt kontrolnych, z wieloma dobrze zachowanymi komórkami β. Dlatego po 6 miesiącach pojawiła się znacząca grupa zwierząt (∼ 40%), które wykazywały znaczną poprawę, a liczba parametrów zbliżała się do wartości obserwowanych w kontrolach zwierząt bez cukrzycy. Jedynym testem, który był w stanie niezawodnie odróżnić zwierzęta odzyskujące zdrowie od kontroli bez cukrzycy, był test tolerancji glukozy. Test tolerancji glukozy przeprowadzono w 9. i 12. miesiącu eksperymentu, a krzywa dla zwierząt odzyskujących wykazano wyraźnie wartości patologiczne podobne do grupy cukrzycowej i znacznie różniące się od tych u zwierząt kontrolnych bez cukrzycy. Obie grupy streptozotocyny zareagowały zmniejszonym wydzielaniem insuliny. Podsumowując, cukrzyca wywołana streptozotocyną u szczurów była stabilna przez 6 miesięcy; później jednak nastąpił znaczny powrót do zdrowia u ∼ 40% zwierząt. Funkcjonalna niewydolność odzysku w tym okresie (7-12 miesięcy po zastosowaniu streptozotocyny) może zostać odkryta przez test tolerancji glukozy. Wydzielanie insuliny u zwierząt odzyskujących zdrowie jest prawdopodobnie wystarczające w spoczynku; jednak zwiększone obciążenie glukozą demaskuje nadal upośledzoną tolerancję glukozy. U większości zwierząt (>60%) nie zaobserwowano poprawy, a ciężka cukrzyca utrzymywała się przez okres 12 miesięcy. Spontaniczne wyleczenie z cukrzycy wywołanej streptozotocyną zostało już opisane u noworodków szczurów, u których streptozotocyna była stosowana przy urodzeniu,20 i u dorosłych zwierząt, ale z małą dawką streptozotocyny.21,22

Streptozotocyna jest również stosowana do indukcji cukrzycy u innych gatunków, oprócz szczurów. U myszy cukrzyca typu I może być indukowana przez pojedynczą wyższą dawkę streptozotocyny lub przez wielokrotne zastosowanie niższych dawek, obie stosowane dootrzewnowo. W przypadku stosowania pojedynczej dawki opisano wiarygodne indukowanie dawek 200 mg / kg.23,24 poważną wadą stosowania pojedynczej dawki jest bardzo wysoka natychmiastowa śmiertelność (do 90% dla 180 mg/kg w naszych rękach). Wielokrotne stosowanie streptozotocyny jest zwykle wykonywane w dawkach 40-50 mg/kg mc. na dobę przez 5 kolejnych dni.Charakterystyczne objawy cukrzycy (hiperglikemia, glikozuria, stagnacja masy ciała) rozwijają się po podaniu ostatniej dawki. Myszy zwykle wykazują znaczące różnice międzygatunkowe: u samców myszy stężenie glukozy w osoczu po zastosowaniu streptozotocyny było znacznie wyższe niż u samic myszy. Ponieważ wiadomo, że podawanie testosteronu zwiększa odpowiedź hiperglikemiczną u kastrowanych mężczyzn i kobiet, a także u nie kastrowanych kobiet, prawdopodobnie przyczynia się do diabetogennego działania streptozotocyny.26

wyniki w śwince morskiej są kontrowersyjne. Według niektórych badań świnki morskie są odporne na diabetogenne działanie streptozotocyny.Z kolei inne badania opisują wiarygodny model cukrzycy wywołanej streptozotocyną, oparty na zmniejszonej szybkości wzrostu, dysfunkcji komórek β, polidypsji, wielomoczu i glikozurii.Różnice w eksperymentalnych metodach indukcji cukrzycy, zwłaszcza dawkowania i stosowania, mogą być odpowiedzialne za te rozbieżności. Najbardziej zalecane metody obejmują śródsercowe podanie streptozotocyny (200 mg/kg mc.) poprzedzone podaniem insuliny,29 śródsercowych wstrzyknięć streptozotocyny (150 mg/kg mc.) bez insuliny,28 lub dożylne podanie streptozotocyny.W oparciu o różnice w metodzie indukcji cukrzycy, parametry cukrzycy, czas przebiegu choroby i związana z nią śmiertelność również różnią się między modelami. W naszych warunkach doświadczalnych, podczas gdy podanie dootrzewnowe streptozotocyny (300 mg/kg) nie wywoływało żadnych objawów cukrzycy, dożylne podanie streptozotocyny (150 mg/kg) prowadziło do znacznej glikozurii. Analiza histologiczna trzustki nie wykazała żadnych oznak niszczenia wysepek, niezależnie od sposobu podawania streptozotocyny. Nawet glikozuria obserwowana po dożylnym podaniu streptozotocyny może nie być objawem cukrzycy, ale raczej wynikiem bezpośredniego działania nefrotoksycznego streptozotocyny, który został opisany u pacjentów. Hipotezę tę potwierdza fakt, że codzienne podawanie insuliny (5 i. u. / kg) nie zapobiegało glikozurii.

w odniesieniu do króliczego modelu cukrzycy wyraźnie przeważają badania z wykorzystaniem modelu indukowanego alloxanem. Badania z cukrzycą wywołaną streptozotocyną u królików są rzadkie i sprzeczne. Istnieją pewne dowody na diabetogenne działanie streptozotocyny u dorosłych królików, a także u płodów, ale inne badania argumentują przeciwko tej możliwości.27,31-34

u dużych ssaków streptozotocyna była z powodzeniem stosowana do wywoływania cukrzycy u psów i świń. U psów stosowanie streptozotocyny wiązało się z wysoką śmiertelnością i dlatego opracowano kilka technik w celu zmniejszenia dawki streptozotocyny i związanej z nią śmiertelności. Freyse et al.Połączone częściowe wycięcie trzustki i wlew streptozotocyny w małej dawce (2 mg/kg mc.) do tętnicy trzustkowo-dwunastniczej. Inne techniki obejmują połączone dożylne podawanie streptozotocyny i alloksanu oraz nadrenalny wlew dotętniczy streptozotocyny i alloksanu po zatkaniu balonu aorty brzusznej.36,37 innym dużym gatunkiem ssaka wrażliwym na diabetogenne działanie streptozotocyny jest świnia (i minipig). Aby zapewnić niezawodne działanie diabetogenne streptozotocyny zarówno u świń, jak i minipig, potrzebna jest dawka 100-150 mg / kg.W przypadku minipigów donoszono również o skutecznym wywołaniu cukrzycy przez dwie małe dawki (40 mg / kg mc.).39