LETTER

Neisseria meningitidis kan een mogelijk fatale systemische ziekte veroorzaken. Vroege diagnose en snelle antimicrobiële interventie zijn cruciaal voor gunstige klinische resultaten. Resistentie tegen antibiotica is gemeld voor penicillinen (1), tetracycline (2) en sulfonamiden (3), evenals voor chinolonen (4) en rifampine (5).

N. meningitidis brengt twee belangrijke porinen tot expressie, PorA en PorB, die antigenisch variabel zijn tussen stammen en binnen een stam, en PorA is fasevariabel (willekeurige aan/uit-schakeling) (6). Neisseria gonorrhoeae drukt een enkele porine uit, PorB. Veranderingen in porine expressie of variant porinen mediëren antibioticaresistentie bij verschillende gramnegatieve bacteriën, waaronder N. gonorrhoeae (7,-10). Bij N. meningitidis verhoogt de afwezigheid van PorB de weerstand tegen tetracycline en cefsulodin in vitro (11). De rol van PorA in antimicrobiële resistentie is niet gemeld voor de meningococcus. Naast de voorgestelde rol in immune evasion, we hypothesized dat fase-variabele Pora expressie kan een duidelijk mechanisme voor de meningococcus om antimicrobiële stoffen te ontwijken als PorA bemiddelt antibiotische opname of uitsluiting. We genereerden stammen zonder Pora of PorB en voerden MIC-tests uit. We hebben ook getest of veranderde Pora expressie wordt geselecteerd door antimicrobiële blootstelling tijdens de loop van de mic assay.

De porA-en porB-genen met flankerende sequenties werden versterkt uit N. meningitidis-stam MC58 en gekloond tot pGEM T-easy. Inverse PCR gevolgd door zelf-ligatie leverde plasmiden met interne schrappingen en introduceerde restrictieplaatsen. De LacZ / kanamycin cassette (12) werd gekloond in de geïntroduceerde SmaI-site van het verwijderde Pora-allel, wat plasmide pPorALacZKan opleverde. Een chlooramfenicol-acetyltransferase-gen werd versterkt en gekloond in de geïntroduceerde bglii-site van het verwijderde porB-allel, in plasmide pPorB:CAT. De Pora lacZ kan of porB::kattenconstructies werden omgezet in N. meningitidis stam ±9 (13) om stammen ± 9ΔPorA en ± 9ΔPorB op te leveren. Allelische vervanging van wild-type Pora of porB allelen door het mutant allel werd bevestigd door PCR en sequencing, evenals SDS-pagina van Sarkosyl-geëxtraheerde buitenste membraaneiwitten (Fig. 1 bis).

analyse van porine-expressie tijdens MIC-analyse. (A) membraaneiwitten werden geïsoleerd door Sarkosylextractie en 10 µg werd gescheiden op 8 tot 12% bis-Tris acrylamidegels voorafgaand aan coomassie-kleuring. Rijstrook 1, ± 9; rijstrook 2, ± 9ΔPorA; rijstrook 3, ± 9ΔPorB. B) monsters van de laatste put met troebelheid werden op BHI-agar geplateerd en immunoblokt met de PorA-specifieke MAb MN14C11.6.

MIC werden beoordeeld met behulp van een bouillonmicrodilutiemethode in 96-wells platen (14) met behulp van bacteriën die ‘ s nachts werden gekweekt op aangevuld BHI-agar bij 37°C en gedurende ongeveer 4 uur subcultureel schudden in BHI-bouillon bij 37°C alvorens te worden aangepast tot ongeveer 5 × 105 CFU/ml op basis van de optische dichtheid bij 600 nm (OD600). Na toevoeging van 50 µl aan serieel verdunde antibiotica werden MICs geregistreerd na een nachtelijke groei bij 37°C (Tabel 1) als concentraties waarbij geen troebelheid werd waargenomen. Elke test werd drie keer gedaan, elke keer in drievoud. Voor elke behandeling waren MICs identiek binnen en tussen de tests.

onze resultaten bevestigden dat verlies van meningokokkenporbexpressie de resistentie tegen tetracycline verhoogt (11). Mutaties in PorB dragen ook bij tot resistentie tegen tetracycline in N. gonorrhoeae (9, 15). Aanbevolen combinatietherapie voor multiply resistente N. gonorrhoeae omvat injecteerbaar ceftriaxon en oraal doxycycline of azithromycine (16). In dit verband is het opmerkelijk dat de meningokokken-9δporb-mutantstam een verminderde gevoeligheid voor doxycycline had. We merkten een verminderde gevoeligheid voor cefalothine op voor ± 9ΔPorB en ook voor de cefalosporinen cefotaxime en ceftazidim. In een eerder rapport werd een verband gelegd tussen N. meningitidis PorB-mutatie en een verhoogde cefsulodin-resistentie (11). In N. gonorrhoeae, PorB loop 3 varianten dragen ook bij aan verhoogde cefalosporine resistentie (17). Onze bevestiging dat Neisseria PorB de gevoeligheid voor cefalosporine moduleert, verhoogt de mogelijkheid dat een vermindering van de gevoeligheid voor deze klasse klinisch kan optreden of wordt vergemakkelijkt door mutaties in PorB in meningokokken of gonokokken.

het gebruik van fluorochinolonen wordt niet langer aanbevolen voor een gonokokkeninfectie (18) en puntmutaties in PorB1b van N. gonorrhoeae dragen bij aan een verminderde gevoeligheid van N. gonorrhoeae voor ciprofloxacine. Expressieveranderingen in gonokokkenporine veranderen de resistentie tegen ciprofloxacine (19); We vonden dat mutatie van Meningokokkenporb ook leidt tot een verminderde gevoeligheid voor ciprofloxacine. Omgekeerd was deze stam gevoeliger voor rifampine, de andere belangrijke keuze voor meningokokkenprofylaxe, misschien door een veranderde membraanarchitectuur, zoals is gesuggereerd voor een veranderde rifamicineresistentie van colistine-resistente Acinetobacter baumannii (20).

daarentegen zagen we geen veranderingen in gevoeligheid van ± 9ΔPorA in vergelijking met de Pora+ – moederstam voor een van de geteste antibiotica (Tabel 1). Dit suggereert dat ofwel PorA geen directe rol speelt bij het binnendringen van antimicrobiële stoffen in de cel of dat er selectie is voor verminderde Pora-expressie via fasevariatie tijdens de mic-test, hetzij in de ouderstam of in ± 9ΔPorB, waardoor mogelijk Pora-gemedieerde antibiotische binnendringing wordt gemaskeerd. Om dit te beoordelen, hebben we bacteriën geà soleerd uit de uiteindelijke put waarin troebelheid werd waargenomen en Pora-expressie beoordeeld door kolonieimmunoblotting met behulp van het anti-P1.7 murine monoclonal antilichaam (MAb) MN14C11.6 (verkregen uit NIBSC, Verenigd Koninkrijk). Als controlegroep werd de reactiviteit vergeleken tussen de ouderstam ± 9 en de Pora-mutantstam ± 9ΔPorA. Hieruit bleek dat de Pora-expressie tussen controleputten en na blootstelling aan een van de geteste antimicrobiële stoffen ongewijzigd bleef (zie Fig. 1B); verminderde gevoeligheid van ± 9ΔPorB is dus niet te wijten aan veranderde Pora-expressieniveaus.

onze resultaten komen overeen met eerdere rapporten voor een rol voor N. meningitidis PorB bij cefalosporines en tetracycline resistentie (9, 11, 15). De parallellen met gonokokkenporb1b met betrekking tot antibioticaresistentie zijn opvallend. Het uitschakelen van PorB expressie verminderde ook de gevoeligheid voor meningokokken voor doxycycline, een van de aanbevolen therapieën voor multiply resistente N. gonorrhoeae. Dit suggereert verontrustend dat selectieve druk kan leiden tot het ontstaan van gonokokken PorB varianten met verminderde doxycycline gevoeligheid. Hoewel we slechts 2-voudige verschillen registreerden die op zichzelf onwaarschijnlijk zijn dat ze leiden tot falen van de behandeling, heeft de synergie van PorB-variatie met andere mutaties het potentieel om het resistentiespectrum van meningokokken en gonokokken uit te breiden. We vonden geen bewijs van een rol voor PorA in antimicrobiële doorvoer door het buitenmembraan.