Aspectos Metodológicos

Streptozotocin (2-desoxi-2-(3-metil-3-nitrosoureido)-d-glucopyranose), um antibiótico com antineoplásicos efeitos produzidos por Streptomyces achromogenes bactérias, destrói seletivamente os receptores β-células das ilhotas pancreáticas de Langerhans (Fig. 9.1).A estreptozotocina induz quebras da cadeia de ADN e alquilação do ADN, o que conduz à necrose das células β pancreáticas.12,13 estreptozotocina é transportada dentro da célula-β pelo GLUT2 transportador de glicose, e a expressão do GLUT2 é, portanto, necessária para o efeito tóxico.13,14 as vias sinalizadoras do efeito tóxico da estreptozotocina envolvem a activação da NO-sintase indutível, aumento da concentração NO,15 e aumento da geração H2O2.16

FIGURA 9.1. Histologia e imunohistoquímica dos ilhéus pancreáticos de Langerhans no grupo de controlo (painel esquerdo) e de ratos diabéticos induzidos pela estreptozotocina (painel direito).em ratos diabéticos, o número e o tamanho dos Ilhéus foram reduzidos e a imunoreactividade da insulina diminuiu.

desenvolvimento de diabetes mellitus após a aplicação de estreptozotocina é muito rápida, especialmente no rato. A sensibilidade das células-β à glucose já é significativamente reduzida 2 horas após a aplicação de estreptozotocina; a destruição e redução significativa do número de células-β ocorre em várias horas após a aplicação.Este facto é acompanhado por alterações nos níveis plasmáticos de glucose e insulina: 2 horas após a aplicação, desenvolve-se uma hiperglicemia sem alterações nos níveis plasmáticos e de insulina pancreática, seguida de hipoglicemia com níveis plasmáticos aumentados de insulina, mas sem alterações nos níveis de insulina pancreática. Um dia após a aplicação de estreptozotocina, os ratos apresentam todos os sintomas característicos da diabetes, incluindo hiperglicemia, glicosúria, poliúria e níveis plasmáticos e de insulina pancreática reduzidos.18

estreptozotocina pode ser aplicada numa dose única ou de forma repetida, normalmente dissolvida em tampão citrato (pH 4.5), por injecção intravenosa, intraperitoneal ou intra-arterial. Nas nossas experiências, a diabetes foi induzida de forma fiável por uma única injecção intravenosa de estreptozotocina dissolvida em tampão citrato na veia da cauda, numa dose de 65 mg/kg de peso corporal. A dose necessária para a indução da diabetes no rato varia entre 40 e 60 mg/kg de peso corporal, embora por vezes sejam notificados valores mais elevados.Os sintomas diabéticos correlacionam-se bem com a dose utilizada. Em geral, com doses inferiores a 40 mg/kg de peso corporal, apenas se observam ligeiras alterações nos níveis de glicemia, glicosúria e insulina no plasma, e estas ligeiras alterações tendem a normalizar-se espontaneamente em até 25% dos animais.Com uma dose suficiente de estreptozotocina, a indução de diabetes no rato é fácil, rápida e fiável. Na maioria dos estudos que utilizam este modelo de rato, no entanto, a patogênese da diabetes e os sintomas associados foram estudados apenas por várias semanas ou meses, durante os quais a diabetes é totalmente desenvolvida e mantida. Os efeitos a longo prazo da estreptozotocina e possível recuperação da diabetes induzida pela estreptozotocina foram explorados muito menos.nos nossos experimentos, seguimos ratos com diabetes induzida por estreptozotocina durante 1 ano, e a recuperação foi observada em uma proporção significativa de animais. Todos os 152 ratos apresentaram diabetes total nos primeiros 6 meses da experiência; na segunda metade do ano, dois grupos diferentes puderam ser claramente distinguidos. No grupo diabético (n = 92), glicemia manteve-se elevada (> 18 mmol/L), o peso corporal não aumentar os níveis plasmáticos de insulina foram mantidos baixos, e a análise histológica revelou redução no número e tamanho das ilhotas pancreáticas, com a falta de insulina, células secretoras. Em contraste, o grupo de recuperação (n = 60) mostrou diferenças significativas no segundo semestre do ano, que não estiveram presentes nos primeiros 6 meses da experiência.: glicemia mais baixa (< 12 mmol / L), aumento constante do peso corporal e níveis plasmáticos mais elevados de insulina, que se aproximaram dos valores encontrados em animais de controlo. Além disso, a estrutura histológica dos ilhéus pancreáticos foi semelhante à dos animais de controlo, com uma série de células β bem preservadas. Portanto, após 6 meses houve um grupo significativo de animais (∼ 40%) que mostrou uma recuperação significativa, com uma série de parâmetros aproximando valores observados no controle, animais não diabéticos. O único teste que foi capaz de distinguir de forma fiável os animais de recuperação dos controlos não diabéticos foi o teste de tolerância à glucose. O teste de tolerância à glicose foi realizado nos 9 e 12 meses da experiência, e a curva para os animais de recuperação mostrou claramente valores patológicos semelhantes ao grupo diabético e significativamente diferentes dos dos animais de controlo não diabéticos. Ambos os grupos de estreptozotocina responderam por uma diminuição da secreção de insulina. Em conclusão, a diabetes mellitus induzida pelo estreptozotocina em ratos foi estável durante 6 meses.; em seguida, no entanto, uma recuperação significativa desenvolveu-se em ∼ 40% animais. A insuficiência funcional da recuperação neste período (7 a 12 meses após a aplicação de estreptozotocina) pode ser descoberta através do teste de tolerância à glucose. A secreção de insulina em animais de Recuperação é provavelmente suficiente em repouso; no entanto, um aumento da carga de glucose desmascara a tolerância à glucose ainda deficiente. Na maioria dos animais (∼ 60%) não foi observada recuperação e a diabetes grave persistiu ao longo do período de 12 meses. Já foi descrita uma recuperação espontânea da diabetes induzida pelo estreptozotocina em ratos recém-nascidos, nos quais o estreptozotocina foi aplicado no nascimento,20 e em animais adultos, mas com doses baixas de estreptozotocina.21,22

estreptozotocina é também utilizado para indução de diabetes noutras espécies, para além do rato. No ratinho, a diabetes tipo I pode ser induzida quer por uma dose única mais elevada de estreptozotocina, quer por aplicação repetida de doses mais baixas, ambas aplicadas intraperitonealmente. No caso de uma aplicação de dose única, é descrita uma indução fiável para doses de 200 mg/kg.23,24 uma desvantagem grave da aplicação de dose única é a letalidade imediata muito elevada (até 90% para 180 mg/kg nas mãos). A aplicação repetida de estreptozotocina é geralmente realizada com doses de 40-50 mg/kg por dia aplicadas durante 5 dias consecutivos.Os sintomas diabéticos característicos (hiperglicemia, glicosúria, peso corporal estagnado) desenvolvem-se após a aplicação da última dose. Os ratinhos apresentam tipicamente diferenças significativas entre géneros: no ratinho macho, os níveis plasmáticos de glucose após a aplicação de estreptozotocina foram significativamente mais elevados do que no ratinho fêmea. Uma vez que se sabe que a administração de testosterona aumenta a resposta hiperglicémica em homens e mulheres castrados, bem como em mulheres não castradas, provavelmente contribui para os efeitos diabetogénicos da estreptozotocina.Os resultados na cobaia são controversos. De acordo com alguns estudos, as cobaias são resistentes aos efeitos diabetogénicos da estreptozotocina.Em contraste, outros estudos descrevem um modelo fiável de cobaia da diabetes induzida pela estreptozotocina, com base na taxa de crescimento reduzida, disfunção das células β, polidipsia, poliúria e glicosúria.As diferenças nos métodos experimentais de indução da diabetes, especialmente a dosagem e a aplicação, podem ser responsáveis por estas discrepâncias. Os métodos mais recomendados incluem a aplicação intracardíaca de estreptozotocina (200 mg/kg) precedida pela administração de insulina,29 injecção intracardíaca de estreptozotocina (150 mg/kg) sem insulina,28 ou aplicação intravenosa de estreptozotocina.Com base nas diferenças no método de indução da diabetes, os parâmetros diabéticos, o tempo de progressão da doença e a letalidade associada também diferem entre os modelos. Em nossas condições experimentais, enquanto a aplicação intraperitoneal de estreptozotocina (300 mg / kg) não induziu quaisquer sintomas diabéticos, a administração intravenosa de estreptozotocina (150 mg/kg) levou a glicosúria significativa. A análise histológica do pâncreas não revelou quaisquer sinais de destruição dos Ilhéus, independentemente do método de administração de estreptozotocina. Mesmo a glicosúria observada após administração intravenosa de estreptozotocina pode não ser o sintoma diabético, mas sim o resultado de um efeito nefrotóxico directo da estreptozotocina, que foi descrito em doentes. Esta hipótese é apoiada pelo facto de uma administração diária de insulina (5 U. I./kg) não ter prevenido a glicosúria.no que diz respeito ao modelo da diabetes no coelho, prevalecem claramente os estudos que utilizam o modelo induzido pela aloxan. Os estudos com diabetes induzida pelo estreptozotocina no coelho são raros e contraditórios. Há alguma evidência de efeitos diabetogénicos da estreptozotocina em coelhos adultos, bem como fetos, mas outros estudos argumentam contra esta possibilidade.27,31-34

em grandes mamíferos, o estreptozotocina foi utilizado com sucesso para induzir diabetes no cão e no porco. No cão, a aplicação de estreptozotocina foi associada a elevada mortalidade e, portanto, foram desenvolvidas várias técnicas para reduzir a dose de estreptozotocina e a mortalidade associada. Freyse et al.Pancreatectomia parcial combinada e perfusão de dose baixa (2 mg/kg) de estreptozotocina na artéria pancreaticoduodenal superior. Outras técnicas incluem a administração intravenosa combinada de estreptozotocina e aloxan, e perfusão intra-arterial suprarenal de estreptozotocina e aloxano após oclusão Balão da aorta abdominal justarenal.36,37 outra grande espécie mamífera sensível aos efeitos diabetogénicos do estreptozotocina é o porco (e minipig). Para um efeito diabetogénico fiável da estreptozotocina em suínos e minipig, é necessária uma dose de 100-150 mg / kg.Nos minipiggs, foi também notificada uma indução bem sucedida da diabetes por duas doses baixas (40 mg/kg).39