activering van RNase H

RNase H is een alomtegenwoordig enzym dat de RNA–streng van een RNA-DNA-duplex afbreekt. Het is geïdentificeerd in organismen zo divers als virussen en menselijke cellen (Crouch en Dirksen, 1985). Ten minste twee klassen van RNase H zijn geà dentificeerd in eukaryotic cellen. Meerdere enzymen met RNase h-activiteit zijn waargenomen in prokaryoten (Crouch en Dirksen, 1985). Hoewel RNase H betrokken is bij DNA-replicatie, kan het andere rollen in de cel Spelen en wordt gevonden in het cytoplasma, evenals de kern (Crum et al., 1988). Nochtans, wordt de concentratie van het enzym in de kern verondersteld om groter te zijn en een deel van het enzym dat in cytoplasmic voorbereidingen wordt gevonden kan aan kernlekkage toe te schrijven zijn.

De precieze herkenningselementen voor RNase H zijn niet bekend. Nochtans, is het aangetoond dat oligonucleotides met DNA-als eigenschappen, zo kort zoals tetramers RNase H kunnen activeren (Donis-Keller, 1979). Veranderingen in de suiker invloed RNase h activering als suiker modificaties die resulteren in RNA-achtige oligonucleotiden, bijvoorbeeld 2 ‘- fluor of 2 ‘ – methoxy lijken niet te dienen als substraten voor RNase H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). Veranderingen in de oriëntatie van de suiker op de base kunnen ook de RNase h-activering beïnvloeden, aangezien α-oligonucleotiden RNase H niet kunnen induceren of parallelle gloeiing vereisen (gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Bovendien, beà nvloeden de backbone wijzigingen de capaciteit van oligonucleotides om RNase H. te activeren. Methylfosfonaten activeren RNase H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). Fosforothioaten daarentegen zijn uitstekende substraten (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein and Cheng, 1993). Bovendien, zijn de chimeric molecules bestudeerd als oligonucleotides die aan RNA binden en RNase H activeren (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Bijvoorbeeld, oligonucleotiden samengesteld uit vleugels van 2’-methoxyfosfonaten en een vijf-basisspleet van deoxyoligonucleotiden binden aan hun doelrna en activeren RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Verder bleek één enkele ribonucleotide in een opeenvolging van deoxyribonucleotiden voldoende te zijn om als substraat voor RNase H te dienen wanneer gebonden aan zijn complementaire deoxy-oligonucleotide (Eder en Walder, 1991).

dat het mogelijk is gebruik te maken van chimerische oligonucleotiden die zijn ontworpen om RNase H te activeren en een grotere affiniteit voor hun RNA-receptoren te hebben en de specificiteit te vergroten, is ook aangetoond (Giles and Tidd, 1992; Monia et al., 1993). In één studie, RNase h-gemedieerde splitsing van Target transcript was veel selectiever toen deoxyoligonucleotiden samengesteld uit methylfosfonaat deoxyoligonucleotide vleugels en phosphodiester gaps werden vergeleken met volledige phosphodiester oligonucleotiden (Giles and Tidd, 1992).

ondanks de informatie over RNase H en de demonstratie dat veel oligonucleotiden RNase H kunnen activeren in lysaat-en gezuiverde enzymetests, is nog relatief weinig bekend over de rol van structurele kenmerken in RNA-targets bij het activeren van RNase H (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder en Walder, 1988). In feite, heeft het directe bewijs dat de activering van RNase H, in feite, het mechanisme van actie van oligonucleotides in cellen is, tot zeer onlangs, ontbroken.

recente studies in onze laboratoria bieden aanvullende, zij het indirecte, inzichten in deze vragen. Isis 1939 is een 20 Mer fosforothioaat complementair aan een sequentie in het 3 ‘ – onvertaalde gebied van ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Het remt de productie van ICAM in endotheelcellen van de menselijke navelstrengen en noordelijke vlekken tonen aan dat ICAM-1 mRNA snel wordt afgebroken. Een 2 ‘ – methoxy analoog van Isis 1939 toont hogere affiniteit voor RNA dan phosphorothioate, is stabiel in cellen, maar remt ICAM-1 eiwitproductie veel minder krachtig dan Isis 1939. Het is waarschijnlijk dat ISIS 1939 het RNA destabiliseert en RNase H. activeert. daarentegen remde ISIS 1570, een 18-mer fosforothioaat dat complementair is aan het translatieinitiatiecodon van het ICAM-1 bericht de productie van het eiwit, maar veroorzaakte geen degradatie van het RNA. Aldus, hadden twee oligonucleotides die RNase H kunnen activeren verschillende gevolgen afhankelijk van de plaats in mRNA waarbij zij (Chiang et al., 1991). Een meer directe demonstratie dat RNase H waarschijnlijk een belangrijke factor in de activiteit van vele antisense oligonucleotide is werd verstrekt door studies waarin reverse-ligation PCR werd gebruikt om splitsingsproducten van bcrabl mRNA in cellen te identificeren die met phosphorothioate oligonucleotides worden behandeld (Crooke et al., 1995).

gezien de opkomende rol van chimerische oligonucleotiden met modificaties in de 3′- en 5′-vleugels die zijn ontworpen om de affiniteit voor de stabiliteit van het doelrna en de nuclease te vergroten en een DNA-type hiaat om te dienen als substraat voor RNase H, zijn ook studies gericht op het begrijpen van de effecten van verschillende modificaties op de efficiëntie van het enzym(de enzymen) van groot belang. In een dergelijke studie op E. coli RNase H, hebben wij gemeld dat het enzym minimale opeenvolgingsspecificiteit vertoont en processief is. Wanneer een chimerische oligonucleotide met 2′-gemodificeerde suikers in de vleugels werd gehybridiseerd met het RNA, was de initiële plaats van splitsing het nucleotide grenzend aan de methoxy-deoxy junctie het dichtst bij het 3 ‘ – einde van het RNA-substraat. De initiële snelheid van splitsing nam toe naarmate de grootte van de DNA-kloof toenam en de efficiëntie van het enzym aanzienlijk minder was tegen een RNA-doel dat duplexed werd met een chimerische antisense oligonucleotide dan een volledig DNA-type oligonucleotide (Crooke et al., 1995).

in latere studies hebben we de interacties van antisense oligonucleotiden met gestructureerde en ongestructureerde targets geëvalueerd, en de effecten van deze interacties op RNase H in meer detail geëvalueerd (Lima and Crooke, 1997). Aan de hand van een reeks niet-splitsbare substraten en Michaelis-Menten analyses konden we zowel binding als splitsing evalueren. We toonden aan dat E. coli RNase H1 een dubbelstrengs RNA-bindend eiwit is. Kd voor de duplex van RNA was 1.6 µM; Kd voor een duplex van DNA was 176 µM; en Kd voor enig-bundel DNA was 942 µM. In tegenstelling, kon het enzym RNA slechts splijten in een RNA-DNA duplex. Elke 2 ‘- Modificatie in het antisense geneesmiddel op de splitsingsplaats remde de splitsing, maar significante ladingsreductie en 2′-modificaties werden getolereerd op de bindingsplaats. Ten slotte verminderde het plaatsen van een positieve lading (b.v. 2’-propoxyamine) in het antisense medicijn de affiniteit en splitsing. We hebben ook de effecten van antisense oligonucleotide-geïnduceerde RNA structuren op de activiteit van E. coli RNase H1 onderzocht (Lima and Crooke, 1997). Om het even welke structuur in het duplexsubstraat werd gevonden om een significant negatief effect op de splitsingssnelheid te hebben. Verder, werd de splitsing van geselecteerde plaatsen volledig geremd, en dit werd verklaard door steric belemmering die door de lijn van RNA wordt opgelegd die of de kleine of belangrijke groeven of heteroduplex doorkruisen. Onlangs hebben wij menselijke RNase H1 gekloond en uitgedrukt. Het eiwit is homoloog aan E. coli RNase H1, maar heeft eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die beschreven voor humaan RNase H type 2 (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). Het enzym wordt gestimuleerd door lage concentraties van Mg2+, geremd door hogere concentraties, en wordt geremd door Mn2+ in aanwezigheid van Mg2+. Het is 33 kDa in molecuulgewicht. Het is dubbelstrengs RNA-bindingsproteã ne en vertoont unieke positionele en opeenvolgingsvoorkeuren voor splitsing (Wu et al., 1999). Bovendien is humaan RNase H2 gekloond, maar tot op heden is het uitgedrukte eiwit niet getoond om actief te zijn (Frank et al., 1998). Zeer onlangs hebben wij over de gevolgen van verscheidene veranderingen gerapporteerd die in menselijk RNase H1 op de activiteit van het enzym worden geà ntroduceerd (Wu et al., 2000). Aldus, hebben wij nu de noodzakelijke hulpmiddelen om de rollen van menselijk RNase H in biologische en farmacologische processen te beginnen onderzoeken en om drugs te beginnen te ontwikkelen die worden ontworpen om met hen effectiever in wisselwerking te staan.

ten slotte, ten minste met betrekking tot RNase h-geïnduceerde degradatie van gericht RNA, hebben we onlangs aangetoond dat in het bereik van 1-150 kopieën van RNA per cel, het niveau van target RNA geen effect heeft op de potentie van antisense-remmers (Miraglia, 2000). Dit is toe te schrijven aan het feit dat het aantal molecules van antisense drug per cel het aantal exemplaren van RNA door verscheidene ordes van grootte overschrijdt. Andere factoren moeten dus tariefbeperkend zijn.