pregătirea și reologia matricei extracelulare

ECM este format dintr-o rețea de gelatină și fibrină. Pentru a prepara componentele ECM, se produce mai întâi o soluție de gelatină de 15% în greutate/v (tip A, 300 bloom din piele porcină, Sigma) prin adăugarea de pulbere de gelatină într-o soluție caldă (70 C) de DPBS (1x soluție salină tamponată cu fosfat Dulbelco fără calciu și magneziu). Gelatina este lăsată să se dizolve complet prin agitare timp de 12 ore la 70 centi C, iar pH-ul este apoi ajustat la 7,5 folosind 1 m NaOH. Soluția este filtrată sterilă și depozitată la 4 CTC în alicote pentru utilizare ulterioară în turnare (<3 luni). O soluție de fibrinogen (50 mg/mL) este produsă prin dizolvarea proteinei plasmatice din sânge bovin liofilizat (Millipore) la 37 centi C în DPBS sterile fără calciu și magneziu. Soluția se menține la 37 centimetric C fără agitare timp de cel puțin 45 min pentru a permite dizolvarea completă. Soluția de transglutaminază (TG) (60 mg/mL) se prepară prin dizolvarea pulberii liofilizate (Moo Gloo) în DPBS fără calciu și magneziu și amestecarea ușoară timp de 20 sec. soluția este apoi menținută la 37 centimetric C timp de 20 min și filtrată steril înainte de utilizare. O soluție stoc CaCl2 (250 mM) este preparată prin dizolvarea pulberii CaCl2 în DPBS fără calciu și magneziu (Corning). Pentru a prepara soluția stoc de trombină, trombina liofilizată (Sigma Aldrich) este reconstituită la 500 U/mL folosind DPBS sterile și păstrată la -20 C. alicoturile de trombină sunt dezghețate imediat înainte de utilizare.

un reometru de tensiune controlat (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) cu un diametru de 40 mm, o geometrie a conului și a plăcii de 2 hectare este utilizat pentru măsurătorile reologiei cernelii. Modulii de stocare prin forfecare (G’) și pierdere (G”) sunt măsurați la o frecvență de 1 Hz și la o tensiune oscilatorie (0,01) de 0,01. Măturările de timp sunt efectuate prin plasarea rapidă a unei soluții ECM preamestecate care conține trombină pe placa Peltier ținută la 37 de centi C.

formulări de cerneală

două cerneluri sunt necesare pentru bioprintarea 3D a modelelor pt perfuzabile. O cerneală, care este utilizată pentru a crea garnitura de perfuzie a cipului, este compusă dintr-un elastomer siliconic din două părți (SE 1700, Dow Chemical) cu o bază 10:1 la catalizator (în greutate) care este omogenizat folosind un mixer centrifugal timp de 2 minute (2000 rpm, ae-310, Thinky Corp, Japonia). Cerneala siliconică este imprimată în decurs de 2 ore de la amestecarea cu catalizatorul. Această cerneală este încărcată într-o seringă (EFD Inc., East Providence, RI) și centrifugat pentru a îndepărta orice bule de aer înainte de imprimare la temperatura camerei. Cealaltă cerneală, o cerneală fugitivă utilizată pentru imprimarea tubului, este compusă din 38% în greutate F127 Pluronic (Sigma) și 100 U/mL trombină în apă deionizată, ultrafiltrată (DIUF). Cerneala fugitivă este vopsită roz prin adăugarea unui colorant pentru reactor de risc pentru vizualizare în Fig. 1 și filmul S1. Pentru a prepara această cerneală, o soluție Pluronică de 40% în greutate F127 în apă este omogenizată folosind un mixer Thinky până când pulberea este complet dizolvată și apoi depozitată la 4 centimetric C. Înainte de Utilizare, o soluție de trombină de 2000 U/mL este adăugată la cerneala fugitivă (Pluronică) la un raport de 1:20 și omogenizată folosind un mixer Thinky. Cerneala fugitivă este apoi încărcată într-o seringă (EFD Inc., East Providence, RI) la 4 C și centrifugat pentru a îndepărta orice bule de aer. Înainte de imprimare, această cerneală este echilibrată la temperatura camerei timp de cel puțin 15 minute.

Bioprintarea tubulilor proximali 3D perfuzabili

construcțiile PT 3D sunt fabricate folosind o bioprinter 3D multimaterială proiectată la comandă, echipată cu patru capete de imprimare adresabile independent, montate pe un portal cu 3 axe, controlat de mișcare, cu un volum de construcție de 725 mm, 650 mm, 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA SUA). Cernelurile sunt adăpostite în butoaie separate pentru seringi la care sunt atașate duze de dimensiuni diferite (adică 50 de milimetri în diametru–410 milimetri în diametru) printr-un luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, SUA). Cernelurile sunt extrudate prin duze de depunere prin aplicarea presiunii aerului (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, SUA), variind de la 10-90 psi, corespunzând vitezelor de imprimare cuprinse între 1 mm/s și 5 cm/s. imprimăm mai întâi garnitura cipului de perfuzie personalizată prin depunerea cernelii siliconice printr-o duză conică de 410 mm pe lamele de sticlă de 50 mm 75 mm. Designul garniturii este creat folosind un script MATLAB personalizat care generează codul G pentru o structură finală a garniturii. După imprimare, garnitura de perfuzie a cipului este întărită la 80 centimetric C într-un cuptor pentru >1 h și păstrată la temperatura camerei înainte de utilizare.

modelarea PTs 3D în cipul de perfuzie necesită o combinație de turnare a ECM și imprimarea cernelii fugitive. În primul rând, soluția ECM este creată prin combinarea a 10 mg/mL fibrinogen, 7,5% în greutate gelatină, 2,5 mm CaCl2 și 0,2% în greutate TG. Această soluție este apoi echilibrată la 37 XQC timp de 15-20 min înainte de utilizare pentru a îmbunătăți claritatea optică a ECM25. Apoi, soluția este amestecată rapid cu trombină la un raport de 500: 1, rezultând o concentrație finală de trombină de 1 U/mL. În decurs de 2 minute la 37 centimetric C, are loc polimerizarea fibrinogenului în gel de fibrină. Din acest motiv, soluția ECM trebuie turnată pe baza cipului de perfuzie imediat după amestecarea cu trombină. Stratul ECM de bază este apoi lăsat să se usuce ușor sub azot, astfel încât să formeze o suprafață plană. Cerneala Fugitive Pluronic f127 (cu trombină de 100 U/mL) este imprimată pe stratul ECM de bază sub forma unui filmament convolut (tubular) folosind o duză conică de 200 mm. Un script Python personalizat (MeCode) este utilizat pentru a specifica calea de instrumente în G-code. Imediat după imprimarea cu cerneală fugitivă, știfturile de perfuzie tubulare metalice interfațate prin garnitura de silicon sunt aduse în contact cu cerneala imprimată. Un strat superior de ECM este apoi format prin turnarea soluției ECM peste tubul imprimat, așa cum este descris mai sus, la o distanță de 1-2 mm de înălțimea pereților garniturii. Dacă celulele, cum ar fi Hndf-urile, sunt încorporate în ECM (Fig. S5), se amestecă direct după perioada de echilibrare, înainte de amestecarea trombinei și turnarea ulterioară. După ce stratul superior ECM este turnat, construcția este acoperită cu o lamelă de sticlă pentru a preveni evaporarea sau contaminarea și este menținută la 37 centimetric C timp de 1 oră pentru a permite polimerizarea fibrinei să se termine și TG să reticuleze rețeaua. Construcția este apoi răcită la 4 centimetric C timp de 15-20 min pentru a lichefia cerneala fugară imprimată, care este spălată din dispozitiv folosind medii cu celule reci, lăsând în urmă conducte deschise care servesc ca rețea tubulară dorită încorporată în ECM cu sau fără celule în spațiul ECM extratubular.

folosind această metodă, am produs, de asemenea, arhitecturi 3D într-o secvență de construire strat cu strat. De exemplu, fiecare strat individual al structurii cu trei straturi prezentat în Fig. S10 a fost construit folosind un protocol de imprimare modificat care încorporează materialele și metodele discutate anterior. După imprimarea primilor tubuli cu cerneală fugitivă, un strat de ECM este turnat peste imprimare și este permis 20 min să se gelifice la 37 centimetric C înainte ca următorul strat proximal de tubuli să fie imprimat cu cerneală fugitivă deasupra stratului gelificat recent. Această construcție succesivă introduce geometria 3D și permite evacuarea cu succes a tuturor canalelor independent după construcție. Coloranții reactorului de risc pe bază de apă sunt perfuzați prin canale și excitați cu lumină UV pentru vizualizare.

pentru a finaliza procesul de asamblare a cipurilor de țesut 3d, fiecare construcție PT este plasată pe o bază prelucrată din oțel inoxidabil și un capac acrilic gros este așezat deasupra. Capacul și baza sunt fixate împreună cu patru șuruburi, formând o etanșare în jurul garniturii de silicon imprimate. Apoi, tubul peristaltic steril cu două opriri (PharMed BPT, Diametru interior de 0,25 mm) este umplut cu suport și conectat la ieșirea unui filtru steril care este atașat la un butoi de seringă de 10 ml (EFD Nordson), care servește ca rezervor media. PTEC media (Proiectat pentru creștere, astfel încât formularea ATCC plus 1% FBS, 1% aprotinin, și 1% anti-anti), care a fost echilibrarea pentru >3 h într-un incubator la 37 C, 5% CO2 se adaugă la rezervorul de mass-media, și tubulatura din rezervor este conectat la priza de cip (metal tubular perfuzia pin). O seringă este apoi utilizată pentru a exercita o ușoară presiune asupra mediului din butoi, forțându-l să intre și să umple complet tubul atașat. Umplerea tubului cu suport media înainte de conectarea acestuia la circuit împiedică introducerea bulelor de aer în sistem. Pentru a finaliza circuitul de perfuzie, tubul de silicon din rezervor este conectat la știftul de perfuzie metalică de intrare de pe cip. Clemele de prindere a furtunului sunt adăugate la intrarea și ieșirea cipului de perfuzie pentru a preveni fluxul necontrolat atunci când este deconectat de la pompa peristaltică, ceea ce poate deteriora epiteliul sau permite intrarea bulelor de aer în sistem. Rezervorul de medii este echilibrat cu condițiile atmosferice din incubator în orice moment cu ajutorul unui filtru steril deasupra rezervorului de medii.

cultura celulară

Ptec-urile imortalizate umane (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) sunt cultivate conform instrucțiunilor ATCC și sunt utilizate pentru toate studiile modelului PT până la pasajul 20. Pentru analiza expresiei genelor, celulele canceroase renale rptec primare umane (Cell Science), ptec imortalizate (RPTEC-TERT1, Evercyte) și a498 (ATCC HTB-44) sunt utilizate și cultivate conform instrucțiunilor furnizorului. Fibroblastele dermice neonatale umane( HNDF), care exprimă GFP (Angio-Proteomie) sunt cultivate conform instrucțiunilor furnizorului și utilizate până la pasajul 15.

analiza expresiei genelor

RPTEC primar uman (Cell Science), rptec-TERT1 imortalizat (Evercyte) și a498 (ATCC HTB-44) celulele canceroase renale sunt cultivate în plăci cu 96 de puțuri conform instrucțiunilor furnizorului și colectate În ziua a 3-a post-confluență prin înlocuirea mediului de cultură cu 100 unkticl / puț de amestec de liză ARN 1x (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101). Apoi, 40 unqql de lizat este amestecat cu un set de bile magnetice de captare a ARNm (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, număr de catalog 312631), incubat peste noapte, prelucrat pentru amplificarea ADN-ului ramificat și analizat conform instrucțiunilor producătorului (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). Sonda PPIB este utilizată ca genă de menaj pentru normalizare. Datele privind intensitatea fluorescenței (Fi) sunt prezentate ca deviație medie și standard a 3 replici biologice.

analiza citokinelor mediei perfuzat

media perfuzat este colectat dintr-un tub pe o perioadă de 25 de zile după însămânțarea celulelor și depozitat la -80 CTC înainte de analiză. Pentru profilarea citokinelor, supernatanții sunt dezghețați pe gheață, diluați 2x în tamponul de diluare a probei (catalog BioRad #M60-009rdpd) și analizați prin ELISA bazată pe tehnologia Luminex folosind Chemokina umană bio-Plex Pro IL-6 (Set #171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) și MCP-1 (Set #171-BK36MR2) și Bio-Plex 200 sisteme (biorad) conform instrucțiunilor producătorului. Datele sunt raportate ca concentrații medii de citokine și deviații standard ale triplicatelor tehnice.

epitelizare și cultură longitudinală

fiecare construcție PT 3D este perfuzată timp de câteva ore cu medii PTEC în incubator înainte de încărcarea / însămânțarea celulelor. Ptec-urile (PTEC/TERT1, ATCC) sunt tripsinizate din vasul lor de cultură și concentrate în medii la ~2 107 celule/mL. Suspensia celulară este apoi încărcată în cipul de perfuzie prin priză (Fig. S3b, c). Construcția încărcată este plasată lateral în incubator timp de câteva ore și este răsturnată cu 180 de centimetrii pe parcursul mai multor intervale de jumătate de oră pentru a permite însămânțarea uniformă a pereților tubulilor, apoi incubată în tub fără flux peste noapte. A doua zi, celulele neaderente sunt eliminate din tub sub flux prin gravitație. Apoi se începe perfuzia de medii proaspete și celulele rămase încep să se grupeze și apoi să crească din acele colonii (Fig. S3f) până când ajung la confluență la aproximativ 3 săptămâni după însămânțare (Fig. S3k). În timpul fazei de creștere, Ptec-urile sunt hrănite cu medii PTEC preparate conform ghidurilor ATCC plus 1% aprotinină (EMD Millipore, utilizat pentru a încetini degradarea ECM), 1% ser fetal bovin (FBS) și 1% antibiotic-antimicotic (Gibco). După maturare, FBS este îndepărtat, iar PTECs se împachetează într-un monostrat epitelial strâns (filmul S2). În ziua 1 post-însămânțare, Ptec – urile sunt expuse la un flux continuu, unidirecțional, la 1 hectolitru/min, echivalând cu tensiuni de forfecare care variază între 0,1 și 0,5 dini/cm2 în funcție de secțiunea transversală a tubului. Mediul este alimentat printr-o pompă peristaltică într-un circuit cu buclă închisă și schimbat la fiecare 2 zile.

studiul de absorbție a albuminei

absorbția albuminei este evaluată pentru modelele PT 3D tipărite, precum și pentru controalele 2D. Primul control constă din Ptecuri cultivate pe plastic de cultură tisulară, în timp ce al doilea control constă din Ptecuri cultivate pe ECM-ul nostru. În fiecare caz, Ptec-urile sunt cultivate până la confluență și lăsate să se maturizeze în medii libere de ser. Albumina serică umană conjugată cu FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030)se suspendă în medii PTEC la 50 hectolitri/mL. Toate probele sunt incubate cu HSA-FITC în mediul lor timp de 2 ore (în cazul perfuziei, se perfuzează prin lumenul deschis). După expunere, toate probele sunt spălate cu volum de 3x și apoi tripsinizate cu 10x tripsină pentru a colecta celulele individuale. Celulele sunt fixate și contracarate cu anticorpi primari și secundari pentru megalin (tabelul S2 enumeră anticorpii specifici utilizați). Celulele din aceste probe și celulele goale sunt analizate prin citometrie în flux (bd LSR Fortessa) și datele sunt colectate din n = 10.000 de celule pe probă. Pentru a obține imagini ale HSA-FITC și megalin în PTECs, probele sunt fixate în poziție cu formalină în loc să fie trysinizate după etapa de spălare. Aceste probe sunt contracarate pentru megalin și imaginate folosind microscopie confocală (Zeiss Lsm710).

testarea Ciclosporinei A

este explorat efectul CysA atât asupra controalelor 2D, cât și asupra PTs 3D bioprintate. În 2D, celulele sunt însămânțate într-un format de 96 de puțuri pe plastic de cultură tisulară și cultivate până la confluență. Acestea sunt hrănite media pe liniile directoare ATCC lui. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) este suspendată în mediul lor la diferite concentrații și incubată cu celule timp de 24 de ore. un test de viabilitate folosind(3-(4,5-dimetiltiazol-2-IL)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2h-tetrazoliu) în prezența metosulfatului de fenazină (MTS) se execută la marcajul 24 h post expunere. Acest test este finalizat pe PTECs la confluența timpurie, dând CysA celulelor în ziua în care au ajuns la confluență, precum și confluența târzie, dând CysA la câteva zile după ce au ajuns la confluență. În special, rezultatele toxicității sunt similare pentru fiecare caz (Fig. 5n). Pentru PTs 3D, CysA este alimentat la diferite concentrații prin lumenul deschis al tubulilor maturi după atingerea confluenței (la ~3 săptămâni), unde nu este inclus ser în mediu timp de cel puțin 10 zile. La 24 de ore după expunerea la CysA, se efectuează un test de scurgere FITC-dextran (descris mai jos) pentru a evalua și cuantifica perturbațiile funcției de barieră a PTECs. În continuare, PT este fixat folosind formalină tamponată de 10% Timp de 1 oră și contracarată pentru actină și DAPI (tabelul s2 enumeră petele specifice utilizate).

măsurători de permeabilitate Difuzivă

pentru a evalua funcția de barieră a epiteliului în 3D, permeabilitatea difuzivă este cuantificată prin perfuzarea mediilor PTEC în lumenul deschis conținând 25 de xqtg/mL FITC-conjugat 70 kDa dextran (FITC-Dex, produs Sigma 46945) la o rată de 15 xqtl/min Timp de 3 min și 1 xqtl / min ulterior timp de ~30-45 min. Întregul test este efectuat sub imagistica cu celule vii, atât cu tubul, cât și cu ECM-ul înconjurător în câmpul vizual (Fig. S9). Modelul de difuzie al FITC-DEX este detectat folosind un microscop fluorescent cu câmp larg (Zeiss Axiovert 40 CFL). Imaginile fluorescente sunt captate înainte de perfuzie și la fiecare 3 până la 5 minute pe o perioadă de 30-45 de minute. Permeabilitatea difuzională a FITC-DEX se calculează prin cuantificarea modificărilor intensității fluorescenței în timp folosind următoarea ecuație34;

Pd este coeficientul de permeabilitate difuzivă, I1 este intensitatea medie la un moment inițial, I2 este o intensitate medie la t ~ 30-45 min, Ib este intensitatea de fundal (Imaginea luată înainte de perfuzia FITC-DEX), iar D este diametrul canalului. Alți cercetători au raportat că Ptec-urile pot resorbi dextran39, ceea ce ar duce la valori ușor mai mari pentru permeabilitatea difuză măsurată.

am investigat, de asemenea, proprietățile de barieră ale tubulilor epiteliali căptușiți folosind un compus cu greutate moleculară mică, inulina (4,5 kDa) care nu este nici resorbită, nici secretată in vivo de Ptec folosind aceeași metodă descrisă mai sus. În mod specific, inulina-FITC (produsul Sigma F3272) este dizolvată în medii PTEC încălzite la 100 hectog/mL și perfuzată în lumenul deschis la o viteză de 20 centicli/min Timp de 3 min și apoi 1,5 centicli/min timp de ~15 min. Întregul test este efectuat sub imagistica cu celule vii, atât cu tubul, cât și cu ECM-ul înconjurător în câmpul vizual (Fig. S7). Modelul de difuzie al FITC-inulinei este detectat folosind un microscop fluorescent cu câmp larg (Leica). Imaginile fluorescente sunt capturate cu o sursă de lumină închisă și o etapă controlată de mișcare înainte de perfuzie și la fiecare 3 până la 5 minute pe parcursul perioadei de 15 minute pentru a colecta măsurători tehnice triplicate.

microscopie electronică

pentru microscopia electronică de transmisie (TEM), Ptec-urile în arhitecturi 2D sau 3D sau țesutul renal uman sănătos obținut dintr-o biopsie standard înainte de transplant sunt fixate folosind 2,5% glutaraldehidă, 1,25% paraformaldehidă și 0,03% acid picric în 0,1 M tampon de cacodilat de sodiu (pH 7,4) timp de cel puțin câteva ore. Probele mici (1 mm 1 mm) sunt îndepărtate și spălate în tampon de cacodilat de 0,1 M și scăldate în osmiumtetroxid 1% (OsO4) (EMS) și 1.5% potassiumferrocianură (KFeCN6) (Sigma) timp de 1 oră, spălată în apă 3x și incubată în 1% acetat de uranil apos (EMS) timp de 1 oră urmată de 2 spălări în apă și deshidratare ulterioară în diferite grade de alcool (10 min fiecare; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Probele sunt apoi introduse în propileneoxid (EMS) timp de 1 oră și incubate peste noapte într-un amestec 1:1 de propileneoxid și TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Canada). A doua zi probele sunt încorporate în TAAB Epon și polimerizate la 60 centimetric C timp de 48 h. Secțiunile Ultrathin (aproximativ 60 nm) sunt tăiate pe un Microtom Reichert Ultracut-s, plasate pe grile de cupru colorate cu citrat de plumb și examinate într-un microscop electronic de transmisie JEOL 1200ex, iar imaginile sunt înregistrate cu o cameră CCD AMT 2K. Analiza imaginii se realizează utilizând software-ul ImageJ.

pentru microscopia electronică de scanare (SEM), ptec-urile perfuzate în 3D sunt fixate folosind formalină tamponată 10% Timp de 1 oră. probele sunt tăiate subțire (~1 mm grosime) pentru a expune celulele care circumscriu lumenul deschis. Fixativul este spălat folosind PBSx2 și deshidratarea ulterioară în diferite grade de etanol (20 min fiecare; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Probele sunt apoi plasate în 50% etanol și 50% hexametildisilazan (HMDS) timp de 30 de minute, urmate de 100% HMDS 3 30 de minute. Toate etapele sunt efectuate într-un recipient de sticlă închis și sigilat. După spălarea finală cu HMDS, probele sunt îndepărtate și plasate într-un recipient deschis sub N2 în hota de fum pentru a se usca. Probele uscate sunt montate pe suporturi de pini din aluminiu folosind bandă conductivă de carbon, pulverizare acoperită cu aur și imaginată cu un Tescan Vega sem.

imunostimularea

imunostimularea urmată de microscopie confocală este utilizată pentru a evalua localizarea celulară a proteinelor în modelele PTEC 2D și 3D. Înainte de imunostimulare, fiecare construcție este spălată cu PBS și apoi fixată timp de 20 min până la 1 oră folosind formalină tamponată 10%. Fixativul este îndepărtat folosind mai multe spălări în PBS timp de câteva ore și apoi blocat peste noapte folosind 1% în greutate albumină serică bovină (BSA) în PBS. Anticorpii primari la proteina celulară sau biomarker de interes sunt incubați cu construcțiile timp de 1 zi la diluțiile enumerate în tabelul S2 într-o soluție de 0,5% în greutate BSA și 0,125% în greutate Triton X-100. Îndepărtarea anticorpilor primari nelegați se realizează folosind o etapă de spălare împotriva unei soluții de PBS sau 0,5% în greutate BSA și 0,125% în greutate Triton X-100 în PBS timp de 1 zi. Anticorpii secundari sunt incubați cu construcțiile timp de 1 zi la diluțiile enumerate în tabelul S2 într-o soluție de 0,5% în greutate BSA și 0,125% în greutate Triton X-100 în PBS. Probele sunt contra-colorate cu NucBlue sau ActinGreen timp de 2 ore și apoi spălate timp de 1 zi în PBS înainte de imagistică.

image rendering and analysis

microscopia cu contract de fază se realizează cu ajutorul unui scop inversat Leica DM IL cu obiective cuprinse între 1,25 x și 40x. microscopia confocală se realizează cu ajutorul unui Zeiss LSM 710 vertical cu obiective de imersie în apă cuprinse între 5x și 40x folosind lasere spectrale la lungimi de undă de 405, 488, 514, 561 și 633 nm. Reconstrucțiile de imagine ale stivelor z sunt efectuate în ImageJ folosind funcția de proiecție z cu setarea intensității maxime a pixelilor. Orice creștere a luminozității se realizează uniform pe o întreagă imagine proiectată în Z. Reconstrucțiile de imagini 3D și filmele rotative (Movie S3) sunt realizate folosind software-ul Imaris. Noul sistem cytosmart (LONZA) în incubator este utilizat pentru a capta imagistica time-lapse (Movie S2). Analiza imaginii pentru cuantificarea permeabilității difuzionale se realizează folosind scripturi MATLAB personalizate care utilizează metode raportate anterior34. Analiza imaginii TEM se realizează cu ajutorul software-ului ImageJ pentru a măsura înălțimea celulei (n 50), densitatea microvililor (n 25) și lungimea microvililor (n 150) pe cel puțin 3 probe independente pentru fiecare afecțiune.

analiza statistică

datele sunt exprimate ca mijloc de deviație standard de la nivelul la sută. Analiza statistică este efectuată folosind MATLAB și semnificația statistică este determinată la o valoare de p < 0,05 determinată de un ANOVA folosind testul de comparație multiplă a perechilor lui Tukey. Diferite niveluri de semnificație (valori p) sunt indicate cu asteriscuri și valori specifice p sunt furnizate în fiecare legendă a figurii.