Aptamerii au apărut ca o categorie nouă în domeniul bioreceptorilor datorită aplicațiilor lor largi, de la biosenzori la terapeutici. Au fost raportate mai multe variații ale procesului lor de screening, numite SELEX, care pot produce secvențe cu proprietățile dorite necesare pentru utilizarea lor finală.

generarea bibliotecii de oligonucleotide monocatenare

prima etapă a SELEX implică sinteza secvențelor de oligonucleotide complet sau parțial randomizate de o anumită lungime flancate de regiuni definite care permit amplificarea PCR a acelor regiuni randomizate și, în cazul ARN SELEX, transcrierea in vitro a secvenței randomizate. În timp ce Ellington și Szostak au demonstrat că sinteza chimică este capabilă să genereze ~1015 secvențe unice pentru bibliotecile de oligonucleotide în lucrarea lor din 1990 privind selecția in vitro, au descoperit că amplificarea acestor oligonucleotide sintetizate a dus la pierderea semnificativă a diversității piscinei din cauza părtinirii PCR și a defectelor fragmentelor sintetizate. Grupul de oligonucleotide este amplificat și o cantitate suficientă din biblioteca inițială este adăugată reacției, astfel încât să existe numeroase copii ale fiecărei secvențe individuale pentru a minimiza pierderea secvențelor potențiale de legare datorate evenimentelor stochastice. Înainte ca biblioteca să fie introdusă în țintă pentru incubație și retenție selectivă, biblioteca de secvențe trebuie convertită în oligonucleotide monocatenare pentru a realiza conformații structurale cu proprietăți de legare a țintei.

incubarea țintei

imediat înainte de introducerea țintei, biblioteca oligonucleotidică monocatenară este adesea încălzită și răcită încet pentru a renatura oligonucleotidele în structuri secundare și terțiare stabile termodinamic. Odată pregătită, biblioteca randomizată este incubată cu țintă imobilizată pentru a permite legarea oligonucleotidei-țintă. Există mai multe considerații pentru această etapă de incubație țintă, inclusiv metoda de imobilizare țintă și strategiile pentru separarea ulterioară a oligonucleotidelor nelegate, timpul și temperatura de incubație, condițiile tampon de incubație și concentrațiile țintă versus oligonucleotide. Exemple de metode de imobilizare țintă includ coloane de cromatografie de afinitate, filtre de testare de legare a nitrocelulozei și margele paramagnetice. Recent, reacțiile SELEX au fost dezvoltate în cazul în care ținta este celulele întregi, care sunt extinse aproape de confluența completă și incubate cu Biblioteca oligonucleotidă pe plăcile de cultură. Condițiile tampon de incubație sunt modificate pe baza țintei intenționate și a funcției dorite a aptamerului selectat. De exemplu, în cazul moleculelor și proteinelor mici încărcate negativ, tampoanele mari de sare sunt utilizate pentru screening-ul de încărcare pentru a permite nucleotidelor să se apropie de țintă și să crească șansa unui eveniment specific de legare. Alternativ, dacă funcția aptamer dorită este legarea proteinelor in vivo sau a celulelor întregi pentru o potențială aplicare terapeutică sau diagnostică, condițiile tampon de incubație similare concentrațiilor plasmatice de sare in vivo și temperaturilor homeostatice sunt mai susceptibile de a genera aptameri care se pot lega in vivo. O altă considerație în condițiile tamponului de incubație sunt concurenții nespecifici. Dacă există o probabilitate mare de reținere a oligonucleotidelor nespecifice în condițiile de reacție, concurenții nespecifici, care sunt molecule mici sau polimeri, alții decât biblioteca SELEX, care au proprietăți fizice similare cu oligonucleotidele bibliotecii, pot fi utilizați pentru a ocupa aceste situri de legare nespecifice. Variația concentrației relative a țintei și a oligonucleotidelor poate afecta, de asemenea, proprietățile aptamerilor selectați. Dacă o bună afinitate de legare pentru aptamerul selectat nu este o preocupare, atunci un exces de țintă poate fi utilizat pentru a crește probabilitatea ca cel puțin unele secvențe să se lege în timpul incubării și să fie păstrate. Cu toate acestea, acest lucru nu oferă o presiune selectivă pentru o afinitate mare de legare, ceea ce necesită ca biblioteca oligonucleotidică să fie în exces, astfel încât să existe concurență între secvențele unice pentru siturile de legare specifice disponibile.

eluția și amplificarea secvenței de legare

odată ce biblioteca de oligonucleotide a fost incubată cu țintă pentru un timp suficient, oligonucleotidele nelegate sunt spălate de ținta imobilizată, folosind adesea tamponul de incubație, astfel încât oligonucleotidele legate în mod specific sunt reținute. Cu secvențe nelegate spălate, secvențele legate în mod specific sunt apoi eluate prin crearea condițiilor de denaturare care promovează desfășurarea oligonucleotidei sau pierderea conformației de legare, inclusiv curgerea în apă deionizată, folosind soluții de denaturare care conțin uree și EDTA sau prin aplicarea căldurii și forței fizice ridicate. La eluția secvențelor legate, oligonucleotidele reținute sunt transcrise invers la ADN în cazul ARN sau selecții de bază modificate sau pur și simplu colectate pentru amplificare în cazul ADN SELEX. Aceste șabloane de ADN din secvențe eluate sunt apoi amplificate prin PCR și transformate în ADN monocatenar, ARN sau oligonucleotide de bază modificate, care sunt utilizate ca intrare inițială pentru următoarea rundă de selecție.

obținerea ssDNAEdit

unul dintre pașii cei mai critici din procedura SELEX este obținerea ADN monocatenar (ssDNA) după etapa de amplificare PCR. Acest lucru va servi ca intrare pentru următorul ciclu, astfel încât este de o importanță vitală ca tot ADN-ul să fie singur catenar și să se piardă cât mai puțin posibil. Datorită simplității relative, una dintre cele mai utilizate metode este utilizarea primerilor inversi biotinilați în etapa de amplificare, după care firele complementare pot fi legate de o rășină urmată de eluția celeilalte fire cu leșie. O altă metodă este PCR asimetric, unde etapa de amplificare se realizează cu un exces de grund înainte și foarte puțin grund invers, ceea ce duce la producerea mai multor fire dorite. Un dezavantaj al acestei metode este că produsul trebuie purificat din ADN dublu catenar (dsDNA) și din alte materiale rămase din reacția PCR. Degradarea enzimatică a catenei nedorite poate fi efectuată prin etichetarea acestei catene folosind un primer probat cu fosfat, deoarece este recunoscut de enzime precum exonucleaza Lambda. Aceste enzime degradează apoi selectiv Catena marcată cu fosfat, lăsând Catena complementară intactă. Toate aceste metode recuperează aproximativ 50 până la 70% din ADN. Pentru o comparație detaliată se referă la articolul de Svobodov și colab. în cazul în care aceste și alte metode sunt comparate experimental. În Selex clasic, procesul de generare a Bibliotecii randomizate cu un singur catenar, incubarea țintei și eluția și amplificarea secvenței de legare descrise mai sus se repetă până când marea majoritate a bazinului reținut constă din secvențe de legare a țintei, deși există modificări și adăugiri la procedură care sunt adesea utilizate, care sunt discutate mai jos.

selecție negativă sau contraedit

pentru a crește specificitatea aptamerilor selectați printr-o procedură SELEX dată, se poate adăuga o selecție negativă sau o selecție contra, înainte sau imediat după incubarea țintă. Pentru a elimina secvențele cu afinitate pentru componentele matricei de imobilizare țintă din piscină, selecția negativă poate fi utilizată acolo unde Biblioteca este incubată cu componente ale matricei de imobilizare țintă și secvențele nelegate sunt reținute. Selecția negativă poate fi, de asemenea, utilizată pentru a elimina secvențele care leagă moleculele sau celulele asemănătoare țintei prin incubarea bibliotecii oligonucleotidice cu analogi țintă cu molecule mici, tipuri de celule nedorite sau proteine non-țintă și reținerea secvențelor nelegate.

urmărirea progresiei selecției

pentru a urmări progresul unei reacții SELEX, numărul de molecule legate țintă, care este echivalent cu numărul de oligonucleotide eluate, poate fi comparat cu aportul total estimat de oligonucleotide după eluție la fiecare rundă. Numărul de oligonucleotide eluate poate fi estimat prin estimări ale concentrației de eluție prin absorbanța lungimii de undă de 260 nm sau etichetarea fluorescentă a oligonucleotidelor. Pe măsură ce reacția SELEX se apropie de finalizare, fracția bibliotecii oligonucleotidice care leagă ținta se apropie de 100%, astfel încât numărul de molecule eluate se apropie de estimarea totală a intrării oligonucleotidelor, dar poate converge la un număr mai mic.

avertismente și considerații

unele reacții SELEX pot genera sonde care sunt dependente de regiunile de legare a primerilor pentru formarea structurii secundare. Există aplicații aptamer pentru care este de dorit o secvență scurtă și, prin urmare, trunchierea grundului. O avansare a metodei originale permite unei biblioteci de ARN să omită regiunile de grund constante, care pot fi dificil de îndepărtat după procesul de selecție, deoarece stabilizează structurile secundare care sunt instabile atunci când sunt formate doar de regiunea aleatorie.