reglarea reticulului sarcoplasmatic Cardiac Ca2+ absorbția de către Fosfolamban

la începutul anilor 1970, o descoperire a fost raportată de Arnold Katz (Tada și colab.1 ), care a demonstrat că fosforilarea membranelor reticulului sarcoplasmatic cardiac izolat a avut loc în principal pe o proteină cu greutate moleculară mică. Această fosfoproteină a fost numită fosfolamban, din cuvintele rădăcinii grecești care înseamnă „a primi fosfat.”1 Fosfolamban este o proteină mică, care cuprinde 52 de reziduuri de aminoacizi și este prezentă în mușchii scheletici cardiaci, netezi și cu mișcare lentă. Cu toate acestea, efectele sale de reglementare au fost studiate în principal în mușchiul cardiac. Studiile in vitro au indicat faptul că fosfolambanul poate fi fosforilat în trei locuri distincte prin diferite protein kinaze: Serina 10, prin protein kinaza c; Serina 16, prin protein kinaza dependentă de cAMP sau cGMP; și treonina 17, prin protein kinaza dependentă de Ca2+ – calmodulină.23 fiecare fosforilare este asociată cu stimularea ratelor inițiale de absorbție a reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+, care este în principal pronunțată la scăzut , rezultând o creștere globală a afinității pompei Ca2+ pentru Ca2+.45 pe baza acestor observații, s-a emis inițial ipoteza că fosfolambanul fosforilat funcționează ca stimulator al enzimei reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+ – ATPază (SERCA2). Cu toate acestea, la sfârșitul anilor 1980, a avut loc o descoperire semnificativă care a demonstrat că fosfolambanul defosforilat este de fapt un inhibitor al transportului Ca2+ al reticulului sarcoplasmatic cardiac pentru Ca2+ și că fosforilarea ameliorează acest efect inhibitor, dând aspectul stimulării induse de fosforilare.6 Această constatare, împreună cu identificarea unei fosfataze proteice asociate reticulului sarcoplasmatic cardiac care poate defosforila fosfolamban,7 a dus la înțelegerea noastră actuală a fosfolambanului ca inhibitor reversibil al activității reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+ ATPază.

Fosfolambanul este, de asemenea, fosforilat in situ în timpul stimulării adrenergice a sistemului de stimulare a consumului de energie. Studiile efectuate pe inimi de bătaie intacte sau miocite cardiace izolate au arătat că atât Serina 16, cât și treonina 17 din fosfolamban devin fosforilate în timpul stimulării izoproterenolului.89 fosforilarea fosfolambanului și creșterile asociate ale ratelor de absorbție a reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2 + au fost sugerate a fi cel puțin parțial responsabile de efectele stimulatoare ale agoniștilor de la Centauri în inima mamiferelor.

caracteristicile structurale ale Fosfolambanului

structura fosfolambanului nu este cunoscută în prezent, dar pe baza secvenței sale de aminoacizi, au fost propuse mai multe modele. Este general acceptat faptul că există două domenii majore: un domeniu hidrofil (AA 1-30, indicând reziduurile de aminoacizi de la 1 la 30), care conține cele trei situri de fosforilare și un domeniu hidrofob (AA 31-52), care este ancorat în membrana reticulului sarcoplasmatic cardiac. S-a sugerat că o parte a domeniului hidrofil se află într-o configurație elicoidală, iar fosforilarea fosfolambanului se poate desface sau perturba această configurație structurală.10 Dovezi din mai multe laboratoare au indicat importanța domeniului hidrofil în medierea efectelor reglatoare ale fosfolambanului asupra pompei Ca2+ a reticulului sarcoplasmatic cardiac.6111213 de fapt, AA 2-18 în fosfolamban au fost sugerate pentru a interacționa cu AA 336-412 și 467-762 în SERCA2 pentru modificarea funcțională.14

domeniul hidrofob al fosfolambanului a fost, de asemenea, propus să aibă o structură elicoidală. În prezent nu există dovezi clare că acest domeniu interacționează cu pompa Ca2+ a reticulului sarcoplasmatic cardiac, deși mai multe studii au sugerat că porțiunea hidrofobă a fosfolambanului este, de asemenea, importantă în medierea efectelor de reglementare.1215 reziduurile de cisteină din domeniul transmembranar-elicoidal-cu-spirală asigură interacțiunea necovalentă între formele monomerice și contribuie la stabilizarea unei structuri pentamerice pentru fosfolamban.16 analiza pentamerilor fosfolambani a indicat că formarea pentamerului a fost cea a unui pachet elicoidal cu bobină stângă, cu un por ionic cilindric.17 dovezi recente au demonstrat că un fermoar de leucină stabilizează asocierea pentamerică fosfolambană și formează un por ionic central,18 care poate permite transferul de ioni Ca2+-selectiv.19 Cu toate acestea, în prezent nu este clar dacă ansamblul pentameric este esențial pentru reglarea funcțională a reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+ ATPază. Studiile de Expresie în sistemele fără celule au indicat că formele monomerice și pentamerice ale fosfolambanului sunt la fel de eficiente în medierea efectelor de reglementare asupra pompei Ca2+.14

o altă teorie privind interacțiunea fosfolamban–Ca2+-ATPază a propus o asociere dimerică a proteinelor pompei Ca2+ în jurul unui pentamer fosfolamban.20 acest model, bazat pe anizotropia fosforescenței rezolvate în timp, a descris o interacțiune preferențială între pompa fără Ca2+și fosfolambanul defosforilat. Fosforilarea fosfolambană a destabilizat interacțiunea și a dus la creșterea mobilității rotative a Ca2+-ATPazei în membrana reticulului sarcoplasmatic cardiac.20

reglarea contractilității miocardice bazale de către Fosfolamban

rolul fosfolambanului în reglarea contractilității miocardice bazale a fost recent elucidat prin dezvoltarea unui șoarece cu deficit de fosfolamban.21 acești șoareci, creați folosind Metodologia de direcționare a genelor în celulele stem embrionare murine, au prezentat funcția cardiacă hiperdynamică, incluzând funcția sistolică crescută,ratele crescute de relaxare a ventriculului stâng, 21 și umplerea ventriculară îmbunătățită.22 inimile cu deficit de Fosfolamban nu numai că s-au relaxat mai repede decât inimile de tip sălbatic, dar au prezentat și parametri inotropi îmbunătățiți, inclusiv rate crescute de dezvoltare a presiunii, care au fost evaluate în preparatele performante de lucru21 și in vivo, folosind analize ecocardiografice.22 aceste constatări au fost fundamentate prin analize in vitro ale cardiomiocitelor ventriculare izolate din inimile cu deficit de fosfolamban, care au prezentat, de asemenea, creșterea ratelor de relengthening, scurtare și cinetica Ca2+.23 parametrii contractili îmbunătățiți au reflectat modificări subcelulare la nivelul reticulului sarcoplasmatic cardiac. Afinitatea pompei Ca2 + pentru Ca2 + a fost semnificativ crescută, iar acest lucru a fost asociat cu creșterea conținutului intraluminal al reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+ în inimile cu deficit de fosfolamban comparativ cu inimile de tip sălbatic.21

importanța funcțională a fosfolambanului în reglarea contractilității cardiace a fost demonstrată în continuare în studiile la șoareci heterozigoți fosfolamban, care conțin o singură alelă orientată spre fosfolamban.24 inimile acestor șoareci exprimă 40% din nivelurile de fosfolamban prezente în inimile șoarecilor de tip sălbatic, iar această expresie fosfolamban redusă este asociată cu creșterea afinității sistemului de transport al reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+ pentru Ca2+ și creșterea parametrilor contractili. Este interesant de observat că atunci când nivelurile de fosfolamban în inimile de tip sălbatic, fosfolamban-heterozigot și cu deficit de fosfolamban au fost reprezentate în raport cu ratele de contracție și relaxare pentru aceste inimi, s-a observat o corelație liniară strânsă (Fig 1), sugerând un rol proeminent pentru fosfolamban în reglarea parametrilor contractili bazali în inima mamiferelor. Mai mult, deoarece nivelurile reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2 + ATPază nu au fost afectate în aceste inimi modificate genetic, 25 aceste date indică faptul că modificările nivelurilor de fosfolamban, care pot reflecta modificări ale stoichiometriei relative a fosfolambanului la reticulul sarcoplasmatic cardiac Ca2+ ATPază, sunt asociate cu modificări paralele ale parametrilor contractili cardiaci. Cu toate acestea, stoichiometria funcțională a fosfolambanului la reticulul sarcoplasmatic cardiac Ca2+ ATPază nu este cunoscută în prezent. Studiile in vitro au raportat valori care variază între 1: 5 și 5:1 Pentru fosfolamban/SERCA2. Studiile in vivo care utilizează șoareci transgenici, care supraexprimă fosfolambanul în mod specific în inimă, au sugerat că „stoichiometria funcțională” a fosfolambanului/SERCA2 este mai mică de 1:1 în membranele reticulului sarcoplasmic cardiac nativ.26 nivelurile de proteine fosfolamban din inimile acestor șoareci transgenici au fost de două ori mai mari comparativ cu inimile de tip sălbatic, iar expresia fosfolamban crescută a dus la o inhibare crescută a afinității Ca2+-ATPază pentru Ca2+, fără efecte asupra Vmax a acestei enzime.26 mai mult, când nivelurile relative ale fosfolambanului la reticulul sarcoplasmatic cardiac Ca2 + ATPază au fost reprezentate grafic în raport cu valorile EC50 ale Ca2+-ATPazei pentru Ca2+ în supraexprimarea fosfolambanului, de tip sălbatic, fosfolamban-heterozigot și fosfolamban-deficit de inimă, s-a observat o corelație liniară strânsă (Fig 2), indicând faptul că fosfolambanul supraexprimat în inimile transgenice a fost cuplat funcțional la Ca2+-ATPază. Afinitatea scăzută a Ca2+-ATPazei pentru Ca2+ în inimile de supraexpresie fosfolamban a fost asociată cu scăderi ale parametrilor contractili și depresie a tranzitorilor Ca2+ în miocitele cardiace izolate comparativ cu miocitele din inimile de tip sălbatic.26 analizele ecocardiografice ale inimilor de la acești șoareci transgenici au demonstrat o scurtare fracționată semnificativ suprimată și o scurtare circumferențială comparativ cu inimile de la șoareci de tip sălbatic.26 luate împreună, aceste studii la șoareci modificați genetic indică faptul că fosfolambanul este un puternic represor atât al parametrilor de contracție, cât și al relaxării în inima mamiferelor.

rolul Fosfolambanului în reacția miocardică a receptorilor adrenergici

studiile efectuate în Inimi izolate și miocite cardiace au demonstrat că administrarea catecolaminei are ca rezultat fosforilarea fosfolambanului în reticulul sarcoplasmatic cardiac, fosfolemman în membranele sarcolemale și troponina I și proteina C în miofibrili. Cu toate acestea, ratele de reacții de fosforilare/defosforilare pe fosfolamban par a fi mai rapide decât cele ale celorlalte fosfoproteine, iar fosfolambanul a fost sugerat a fi un mediator proeminent al răspunsurilor adrenergice-adrenergice în inima mamiferelor. Fosforilarea fosfolambanului, ca răspuns la creșterea nivelurilor de AMPc în timpul administrării agonistului de la XV, este însoțită de creșteri ale activității sistemului de transport al reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+ și rate crescute de relaxare cardiacă.272829 ratele crescute de absorbție a Ca2+ duc la creșterea nivelurilor de sechestrare a reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+, care sunt disponibile pentru contracțiile ulterioare, ducând la creșterea forței contractile. Cu toate acestea, fosfolambanul nu este fosforilat numai de protein kinaza dependentă de cAMP pe Serina 16, ci și de proteina kinaza Ca2+-calmodulină pe treonina 17,89 și contribuția relativă a fiecărei fosforilări în efectele inotrope și lusitropice ale agoniștilor de la XV nu este cunoscută în prezent.

rolul funcțional al fosfolambanului în calea de semnalizare-adrenergică a fost recent elucidat folosind șoarecele cu deficit de fosfolamban. Studiile in vitro efectuate pe miocite izolate și preparate cardiace de la acești șoareci au indicat o atenuare semnificativă a efectelor inotrope și lusitropice ale izoproterenolului în comparație cu preparatele de tip sălbatic.2123 în plus, studiile in vivo care au utilizat analize ecocardiografice ale inimilor ablate cu fosfolamban au demonstrat că efectele stimulatoare ale receptorilor adrenergici au fost, de asemenea, atenuate la animalul intact.22 Astfel, deși fosfolambanul nu este singura proteină implicată în transducția semnalizării cardiace-adrenergice, dovezile experimentale de până acum indică faptul că este una majoră. Funcția fosfolambanului în timpul stimulării catecolaminei inimii sugerează un rol pentru această proteină ca „mecanism de frânare” intern, care permite reacția miocardică rapidă, astfel încât atunci când adrenalina este eliberată într-o situație de „luptă sau fugă”, „frâna” fosfolambanului este atenuată, permițând creșteri rapide ale contracției și relaxării cardiace.

reglarea expresiei Fosfolambanului

Fosfolambanul este produsul unei singure gene și a fost clonat de la mai multe specii, inclusiv porc, pui, șoarece și om. Există>omologie de 96% între regiunile de codificare ale genei fosfolamban dintre aceste specii și până în prezent nu au fost detectate izoforme de fosfolamban.30 gena fosfolambanului a fost mapată la cromozomul uman 6.31 de studii efectuate la șoarece au demonstrat că, în ceea ce privește sistemul circulator, fosfolambanul este exprimat diferențiat, variind de la niveluri ridicate de exprimare în mușchiul ventricular, la niveluri intermediare în mușchii miocardici atriali și pulmonari și la niveluri scăzute, dar semnificative din punct de vedere funcțional, de exprimare în mușchiul neted aortic. Nivelurile diferențiale ale expresiei fosfolambane în compartimentele ventriculare și atriale par să se coreleze cu diferențele în parametrii contractili ai acestor mușchi.32

expresia Fosfolambanului s-a dovedit, de asemenea, a fi reglată în timpul dezvoltării și îmbătrânirii. Creșteri ale expresiei fosfolambanului pe parcursul dezvoltării cardiace au fost observate la șoarece, pui, șobolan și iepure.31323334 în plus, s-a sugerat că scăderile fosforilării fosfolambane în inima de șobolan îmbătrânită sunt asociate cu răspunsurile contractile diminuate ale acestor inimi la stimularea catecolaminei.33

expresia Fosfolambanului miocardic s-a dovedit, de asemenea, a fi reglată de statusul tiroidian atât la șobolan, cât și la iepure.3435 în timpul hipotiroidismului, nivelurile de ARNm fosfolamban nu au fost modificate în atriul și ventriculul iepurelui, în timp ce nivelurile de proteine fosfolamban s-au dovedit a crește în inimile șobolanilor. Aceste niveluri crescute de fosfolamban la nivelul inimii șobolanului au fost asociate cu rate scăzute ale absorbției Ca2+ a reticulului sarcoplasmatic cardiac, în concordanță cu inhibarea crescută a pompei Ca2+ a reticulului sarcoplasmatic cardiac și scăderea contractilității.34 efecte de reglementare opuse au fost observate pentru expresia fosfolamban în timpul hipertiroidismului.3435 hipertiroidismul a fost asociat cu niveluri scăzute de ARNm fosfolamban în atriile și ventriculele iepurelui și niveluri scăzute de proteine fosfolamban în inimile șobolanilor. Scăderile nivelurilor de fosfolamban s-au reflectat prin creșterea ratelor de absorbție a reticulului sarcoplasmatic cardiac Ca2+, în concordanță cu dezinhibarea pompei de Ca2+ și creșterea parametrilor contractili.

investigațiile recente ale modificărilor expresiei genelor, care apar în timpul insuficienței cardiace, au indicat că modificările raportului relativ dintre fosfolamban și SR Ca2+ ATPază pot fi un semn distinctiv al acestei boli.363738 cu toate acestea, există unele discrepanțe în literatura de specialitate cu privire la modul în care expresia fosfolambanului este modificată în timpul insuficienței miocardice. Unele studii efectuate în lipsa inimile umane au demonstrat reduceri ale fosfolamban mRNA37 sau proteine fosfolamban,363738 în timp ce alte studii nu au observat modificări aparente în fosfolamban nivelurile de lipsa inimile umane.39404142 deși continuă să existe controverse cu privire la modificările fosfolambanului în timpul insuficienței cardiace, este clar că modificările intracelulare, care sunt asociate cu reprimarea contractilității cardiace, sugerează un rol al fosfolambanului în etiologia bolii.

rezumat

înțelegerea noastră a rolului fosfolambanului în fiziologia cardiacă a evoluat în ultimele două decenii până la punctul în care această proteină este acum înțeleasă a fi un represor critic al contractilității miocardice. Fosfolambanul, prin efectele sale inhibitoare asupra afinității pompei Ca2+ a reticulului sarcoplasmatic cardiac pentru Ca2+, reprimă atât ratele de relaxare, cât și contracția inimii mamiferelor. Aceste efecte inhibitoare pot fi ameliorate prin (1) fosfolamban fosforilarea, (2) reglarea în jos a expresiei genei fosfolamban și (3) întreruperea interacțiunii fosfolamban–Ca2+-ATPază. Astfel, abordările genetice și intervențiile farmacologice, menite să amelioreze acțiunea inhibitoare a fosfolambanului asupra pompei Ca2 + a reticulului sarcoplasmatic cardiac și relaxarea miocardică, se pot dovedi valoroase în inversarea efectelor mai multor boli în inima mamiferelor. Astfel de intervenții ar putea fi concepute pentru a inhiba fosfolamban fosfataza, stabiliza starea fosforilată a fosfolambanului, întrerupe interacțiunea fosfolamban-Ca2+-ATPază, reduce transcrierea fosfolambanului sau perturba stabilitatea ARNm fosfolamban. Dezvoltarea unor astfel de strategii terapeutice pentru a viza fosfolambanul va fi un obiectiv viitor important pentru îmbunătățirea clinică a contractilității în inima care nu reușește.

note de subsol