subiecți de studiu, specimene clinice și genotipare HLA. Toți subiecții cu antecedente de transfuzie de sânge au fost excluși din studiu. Treizeci și două de familii cu antecedente de sclerodermie simplex au fost recrutate și studiate pentru alelele HLA clasa II și clasa I; 3 generații au fost studiate pentru 20 de familii și 2 generații pentru 12 familii. Trei generații au fost necesare pentru intrarea în studiu pentru toate femeile cu copii, iar participarea tuturor copiilor a fost necesară, deoarece microchimerismul ar putea deriva de la mamă sau de la un copil la acești subiecți. Participarea bărbaților, a copiilor și a femeilor niciodată însărcinate a inclus 2 generații (adică subiectul și mama). Un pacient cu sclerodermie a fost un geamăn; geamănul neafectat a fost, de asemenea, recrutat în studiu. Au fost recrutați treizeci și trei de familii de control sănătoase, inclusiv 22 cu 3 generații și 11 cu 2 generații. Genotiparea HLA a fost finalizată pentru un total de 254 de persoane: 128 în familiile de sclerodermie și 126 în controale. Unii membri ai familiei suplimentare au fost incluse pentru a confirma HLA haplotype misiuni. Din această bază de date, subiecții au fost selectați pentru studii suplimentare atunci când mama subiectului a avut o alelă HLA neasamblată care a fost vizată de teste specifice HLA. Toți subiecții au acordat consimțământul informat, aprobat de Consiliul de revizuire instituțională a Centrului de cercetare a Cancerului Fred Hutchinson.

Pbmc au fost izolate din sânge heparinizat întreg prin diluare în HBSS, urmate de centrifugarea cu gradient Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suedia) la 1,077 g / mL. Pentru unii copii, ADN-ul a fost extras din rădăcinile părului pentru tastarea HLA așa cum s-a descris anterior (9). ADN-ul Genomic a fost extras din Pbmc folosind un kit de extracție Nucleică Isoquick (Orca Research Inc., Bothell, Washington, SUA), conform instrucțiunilor producătorului, și omogenizat în 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). Cantitatea și puritatea ADN-ului au fost determinate prin metode spectrofotometrice standard. Pentru unii subiecți, ADN-ul a fost extras direct din probe de sânge integral.

tastarea pe bază de ADN cu panouri de sondă oligonucleotidice specifice secvenței a fost utilizată pentru a identifica alele specifice la locii DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 și DQB1. Pentru DRB1, un test inițial cu rezoluție scăzută detectează familiile DRB1 DBR1 * 01 la DRB1 * 14 și este urmat de 1 sau mai multe teste de înaltă rezoluție care identifică alele specifice DRB1 așa cum s-a descris anterior (10, 11). Alelele DQA1 și DQB1 au fost determinate folosind metode similare celor descrise anterior (9), cu sonde suplimentare adăugate pentru a detecta alelele nou identificate (12). Antigenele HLA clasa I au fost determinate folosind un test standard de limfocitotoxicitate care discriminează 20 de antigene HLA-a, 30 HLA-B și 8 HLA-CW. Unele probe au fost supuse secvențierii pentru a determina alele specifice HLA clasa I (13). Pentru a confirma alela HLA și atribuirea antigenului și homozigozitatea, mai mulți membri ai familiei au fost genotipați — inclusiv tați și frați ai subiecților, atunci când sunt disponibili.

primeri PCR specifici HLA. Secvențele de Primer au fost proiectate pe baza tuturor secvențelor de alele cunoscute (12). Sinteza primerilor a fost realizată de Oligos etc. (Wilsonville, Oregon, Statele Unite ale Americii). Un set de grunduri a fost conceput pentru a viza un polimorfism HLA clasa I și 3 polimorfisme HLA clasa II vizate. Pentru a viza HLA-B44, a fost proiectat un primer care amplifică un grup de alele HLA-B bazate pe polimorfisme la pozițiile 66, 69 și 75 ale exonului 3 și un alt grup de alele HLA-B bazate pe un polimorfism la poziția 229 a exonului 3. Combinația de primeri amplifică în mod specific alelele HLA-B44, producând un fragment de 190-bp. Toți primerii specifici DRB au fost proiectați pentru a amplifica grupurile de alele bazate pe polimorfisme de secvență în regiunea hipervariabilă a exonului 2. Pentru HLA-DRB5 * 01, Un primer amplifică un grup de alele DRB5 * 01 bazate pe polimorfisme la pozițiile 25, 26, 31, 32 și 38, iar celălalt amplifică un grup de alele DRB5*01 bazate pe polimorfisme între pozițiile 215 și 231. Combinația de primeri amplifică în mod specific alelele HLA-DRB5*01, producând un fragment de 210-bp. Pentru HLA-DRB1 * 04, un primer amplifică un grup de alele DRB1 * 04 bazate pe polimorfisme la pozițiile 25, 26, 31 și 36, iar celălalt amplifică un grup de alele DRB1*04 bazate pe polimorfisme la pozițiile 97 și 110. Combinația de grunduri amplifică în mod specific DRB1*04, producând un fragment de 104-bp. O discriminare suplimentară între alelele DRB1 * 04 a fost realizată prin utilizarea primului primer împreună cu 1 din 2 primeri care discriminează un dimorfism la poziția 258 (codon 86), producând un fragment de 263-bp. Pentru HLA-DRB1*11, Un primer amplifică un grup de alele DRB1*11 bazate pe polimorfisme la poziții 25, 26, 28, 30, 31, 32, și 35 de exon 2, iar al doilea primer amplifică un grup de alele DRB1*11 bazate pe polimorfisme la pozițiile 173 și 174 de exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. Reacțiile PCR au fost efectuate într–un volum de 50 ilqql conținând 1,25-1,5 ilqq ADN genomic, 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/l KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% gelatină în greutate/vol, 260 ilqqmol/L din fiecare deoxinucleotidă, 0,5 U Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, California, SUA), 2,5 U AmpliTaq aur ADN polimerază (Perkin-Elmer a aplicat Biosystems, foster City, California, SUA) și 20 pmol din fiecare grund specific HLA. S-a adăugat apă ultrapură pentru a alcătui volumul final de 50 unktil. Amplificare a constat în 5 minute la 96°C, 35 cicluri la 95°C timp de 35 de secunde, și la 65°C timp de 35 de secunde pentru HLA-B44 (58.5°C pentru DRB5*01; 72°C pentru DRB1*04; 64.5°C pentru DRB1*11), apoi de 72°C, timp de 1 minut, cu un final extensia pas la 72°C timp de 10 minute. Amplificarea optimă, sensibilitatea și specificitatea au fost obținute prin titrarea concentrațiilor de MgCl2 și grund, numărul de termocicluri și temperatura de recoacere. Toate amplificările au fost efectuate într-un termocicler GeneAmp System 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Sensibilitatea testului a fost determinată prin experimente cu vârfuri în care ADN-ul țintă a fost diluat în serie și adăugat la o cantitate fixă de ADN de fundal corespunzător alelelor subiectului. Testele PCR specifice HLA– B44 și DRB5*01 au fost capabile să detecteze cel puțin 1 celulă țintă într-un fundal de 500.000 de celule; testele PCR specifice HLA-DRB1*04 și DRB1*11 au fost capabile să detecteze cel puțin 1 celulă țintă într– un fundal de 100.000 de celule. Fiecare test PCR a inclus următoarele grupuri de control: (a) un control pozitiv al ADN–ului dintr-o linie celulară cu alela HLA de interes (0,2-0,5 hectolitri); (b) un control pozitiv din partea mamei subiectului (0,2–0,5%); (c) un control negativ al ADN-ului dintr-o linie celulară cu aceleași alele HLA ca și subiectul (1,25% și 0,35%); și (d) un control negativ format din toți reactivii PCR fără ADN. Produsele PCR au fost electroforizate la tensiune constantă de 100 V Timp de 1 oră în geluri TBE prefabricate de 6% sau 8% folosind o mini-celulă Novex XCell II (Novex, San Diego, California, SUA). Fiecare gel a inclus controale PCR pozitive și negative și o scară de 100 bp (SLL-100; Gensura, Del Mar, California, SUA). Gelurile au fost colorate cu pata de argint (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, SUA) și uscat cu sistemul de uscare cu gel DryEase (Novex). ADN-ul extras din sângele integral a fost testat în 4 probe de cantitate insuficientă pentru a izola Pbmc. Toate testele au fost efectuate în dublu exemplar, iar majoritatea probelor au fost testate de mai multe ori.

măsuri de precauție PCR. S-a folosit precauție extremă pentru a evita și detecta posibila contaminare PCR. Au fost utilizate zone Separate pentru separarea PBMC, extragerea ADN-ului genomic, configurarea și amplificarea PCR și analiza produselor PCR, cu teste PCR înainte și după efectuate în laboratoare separate. Vârfuri de pipetă rezistente la aerosoli (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, California, SUA) au fost utilizate în toate experimentele, iar mai multe controale negative au fost incluse în toate amplificările PCR.

secvențierea produselor PCR specifice HLA. Șapte microlitri ai produsului PCR inițial specific HLA au fost supuși la 40 de cicluri suplimentare de amplificare utilizând parametrii originali de termociclare. Treizeci de microlitri ai acestui produs PCR au fost electroforezați într-un gel de agaroză ultrapură de 1,75% (GIBCO BRL, Grand Island, New York, SUA) și colorați cu o soluție de bromură de etidiu (0,5 hectolitri/mL). Banda a fost excizată, eluată și purificată folosind un kit de extracție cu gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, California, SUA). Produsul PCR purificat a fost eluat în 30 ilqtl de 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0) și 100 ng a fost adăugat la un amestec de reacție care conține 8,0 ilqtl de reactiv de secvențiere pre-mix (termo Sequenase; Amersham corp., Arlington Heights, Illinois, SUA), 12.Grund de 5 pmol 5′ sau 3′ și 1 inqutl DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Statele Unite ale Americii). S-a adăugat apă ultrapură pentru a se obține un volum final de 20 unktil. Amestecurile de reacție de secvențiere s-au încălzit la 96% C timp de 3 minute într-un termocicler GeneAmp System 9600, urmate de 25 de cicluri la 96% C timp de 10 secunde, 50% C timp de 5 secunde și 60% C timp de 4 minute. Produsele PCR rezultate au fost purificate în coloană și electroforezate ca mai sus. Secvențele de sens și antisens au fost determinate în dublu exemplar pentru produsele PCR specifice HLA ale subiectului și mamei, precum și pentru produsele PCR de linie celulară de control pozitiv. Analiza secvenței a fost efectuată utilizând software-ul Wisconsin versiunea 9.1 a pachetului de la Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, SUA).

pregătirea diapozitivului Cytospin și hibridizarea in situ. Preparatele de diapozitive Cytospin au fost analizate pentru prezența secvențelor specifice cromozomului X și Y, utilizând o tehnică dezvoltată în laboratorul de citogenetică moleculară Fred Hutchinson Cancer Research Center pentru analiza cantitativă a chimerismului în perechi de transplant de celule stem nepotrivite de sex (14). Probele de Cytospin ale celulelor masculine au fost preparate prin centrifugarea a 30.000–60.000 Pbmc proaspăt separate pe lamele de sticlă, 300 unqql pe diapozitiv. Diapozitivele au fost depozitate într-o cameră de deshidratare până la utilizare. Sonda specifică cromozomului X DXZ1 (15) a fost tradusă nick cu digoxigenină, iar sonda specifică cromozomului Y DYZ1 (16) a fost tradusă nick cu biotină. Amestecul de sondă XY a avut o concentrație finală de 0,5% / ml din fiecare sondă în tampon de hibridizare de 50% formamidă, 2% SSC (0,3 M clorură de sodiu și 0,03 m citrat de sodiu) și 10% sulfat de dextran. Acesta a fost denaturat la 72 centimetric C timp de 5 minute, răcit pe gheață și aplicat pe diapozitiv. Diapozitivele au fost digerate în pepsină (0,1 mg/mL în 0.01 m HCl) la 37 centimetric C timp de 3 minute, fixat în formalină tamponată 4% timp de 15 minute, clătit în PBS, deshidratat în etanol (70%, 95% și 100%) și uscat la aer. Toboganele au fost denaturate prin tratament în 2 SSC-uri (72 C-uri) timp de 10 minute, 70% formamidă, 2 SSC-uri (72 C-uri) timp de 3 minute, deshidratate într-o serie de etanol (-20 C-uri) și uscate la aer. Zece microlitri de sondă au fost aplicați pe diapozitiv și apoi montați sub o lamelă de acoperire (22 de 22 mm) sigilată cu ciment de cauciuc. Acesta a fost incubat peste noapte la 42 centimetric C într-o cameră umidificată. Lamele au fost spălate în 55% formamidă, 2 SSC (45 C) timp de 15 minute și 2 SSC (temperatura camerei) timp de 5 minute. Semnalele sondei au fost detectate simultan cu anti-digoxigenină cuplată cu fluoresceină (diluție 1:500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, SUA) și avidină cuplată cu roșu Texas (diluție 1:500; Vector Laboratories, Burlingame, California, SUA) timp de 30 de minute la temperatura camerei în întuneric. După spălarea cu 2 SSC și PBS, au fost montate cu VECTASHIELD (Vector Laboratories). Diapozitivele au fost evaluate direct folosind un microscop Nikon E600 cu epifluorescență cu o lampă cu mercur de 100 W echipată cu filtre de trecere cu bandă simplă, dublă și triplă adecvate. Au fost enumerate doar celule cu 2 semnale cromozomiale vizibile, fără a utiliza niciun accesoriu electronic.