2.1 respirația anaerobă

în timpul respirației, diferite dehidrogenaze asociate membranei oxidează substraturile solubile în apă și reduc menaquinona (MK) în membrană la menaquinol. În condiții aerobe, electronii sunt utilizați pentru a reduce oxigenul în apă, în timp ce în condiții anaerobe, electronii de creștere respiratorie a nitraților sunt transferați în nitrați pentru a produce nitriți (Fig. 5.1). Un donator principal de electroni de respirație este NADH + H + produs în glicoliză și ciclul acidului tricarboxilic. Două tipuri de NADH dehidrogenaze legate de membrană, NDH-I și NDH-II, au fost descrise pentru ca bacteriile să catalizeze oxidarea NADH+H+ la NAD+ (Yagi, 1993). NDH-I este format din 14 subunități, codificate de operonul nuo din Escherichia coli, și conține mononucleotidă flavină (FMN) și mai multe grupuri de fier–sulf pentru a cupla transferul de electroni la pomparea protonilor prin membrană. NDH-II constă dintr-o singură subunitate codificată de gena ndh. NDH-II nu este o proteină membranară integrală, ci asociată cu partea interioară a membranei citoplasmatice. Conține flavin adenină dinucleotidă (FAD) ca grup protetic și transferul de electroni nu este cuplat la translocarea protonilor. În genomul B. subtilis, trei gene, yjlD, yumB și yutJ, codifică potențiale NADH dehidrogenaze de tip NDH-II, în timp ce un operon nuo este absent din genomul B. subtilis (Kunst și colab., 1997). YjlD, redenumit Ndh, constă din 392 de reziduuri de aminoacizi și prezintă 29% identitate de secvență la NDH-II de E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Interesant, cantitatea de proteină Ndh din B. subtilis a fost găsit redus semnificativ în condiții anaerobe (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh pare a fi principala NADH dehidrogenază aerobă a B. subtilis, deoarece mutația genei ndh a prezentat un defect de creștere aerobă (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Între timp, s-a arătat că expresia operonului yjlC-ndh este reglementată de regulatorul Rex, un regulator transcripțional cu detectare redox, care răspunde la raportul NADH/NAD+ (vezi și secțiunea 3.3) (Gyan și colab., 2006). În schimb, expresia genei yumB a fost găsită indusă în condiții respiratorii de nitrați în studiile de transcriptom (E. H Ecacrtig, rezultate nepublicate). Trebuie să se determine dacă YumB și YutJ au activitate NADH dehidrogenază, așa cum sugerează similitudinea secvenței proteice și dacă sunt relevante în condiții de creștere respiratorie a nitraților.

ca și alte organisme aerobe-respirante, B. subtilis posedă o succinat dehidrogenază (sdh) sau mai precis un succinat:chinonă oxidoreductază, SQR (h Inktigerh Oktilll, 1997). Complexul enzimatic este o parte integrantă a membranei citoplasmatice din bacterii și a membranei mitocondriale interioare din eucariote. Catalizează oxidarea succinatului la fumarat cuplat la reducerea chinonei. Prin urmare, enzima este o parte funcțională atât a ciclului acidului citric, cât și a lanțului respirator (h Inktigerh Oktilll, Aasa, von wachenfeldt, Hederstedt, 1992). Sqr în B. subtilis reduce MK și are trei subunități proteice, SdhA, SdhB și SdhC. SdhA este o flavoproteină cu un FAD legat covalent care efectuează oxidarea cu doi electroni a succinatului la fumarat în citoplasmă. SdhB conține trei grupuri de fier-sulf (,, și ) care funcționează în transferul de electroni între grupul flavin și heme b al citocromului b558 în SdhC. SdhC are cinci segmente transmembranare-elicoidale și ancorează dimerul SdhAB pe partea citoplasmatică a membranei și funcționează în transferul de electroni transmembranari la MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoi, Aasa, & Hederstedt, 2000). Cei doi cofactori heme b mediază transferul electronilor prin membrana citoplasmatică către partea exterioară a membranei la care MK este redus și se consumă doi protoni (Hederstedt, 2002). Acest lucru este diferit de E. coli, unde protonii pentru reducerea ubiquinonei la ubiquinol sunt consumați pe partea negativă a membranei, ceea ce nu afectează potențialul membranei. B. subtilis și alți bacili, cum ar fi tulpinile Bacillus megaterium și Bacillus cereus, pot crește în condiții oxice cu succinat ca sursă de carbon și energie (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium și B. cereus nu cresc în condiții anaerobe în prezența glicerolului. În acord, genele pentru o glicerol-3-dehidrogenază lipsesc în genomi. Cu toate acestea, o genă glpD pentru varianta aerobă a sistemului de transfer de electroni localizat în membrană a fost detectată în B. subtilis. Nu s-a găsit nicio omologie a genelor care codifică alte dehidrogenaze primare prezente în E. coli, cum ar fi diverse formiat dehidrogenază, hidrogenaze, L-lactat dehidrogenază, d-aminoacid dehidrogenază, malat:chinonă oxidoreductaze sau chinoproteină glucoză dehidrogenază. Evident, B. subtilis posedă doar un set limitat de dehidrogenaze primare donatoare de electroni, și anume, diferite forme de NDH-II și glicerol-3-fosfat dehidrogenază aerobă.

în condiții aerobe, electronii sunt trecuți de la menaquinol prin complexul citocromului bc1 la citocromul c oxidază de tip AA3. În condiții microaerofile, se utilizează menaquinol oxidaza de tip citocrom bd cu afinitate ridicată de oxigen. Fumaratul ca acceptor de electroni terminali a fost exclus pentru diferiți bacili, inclusiv B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). În consecință, genele pentru o fumarat reductază nu se găsesc în genomul B. subtilis. Alte tulpini de bacili, cum ar fi Bacillus licheniformis și Bacillus circulans, pot respira fumarat ca E. coli.

în condiții de creștere anaerobă, B. subtilis transferă electronii exclusiv către nitrat reductaza respiratorie. În bacterii, sunt clasificate trei sisteme diferite de nitrați reductază: reductazele azotate dependente de nad(P)H citoplasmatice asimilatoare (Nas), reductaza de nitrați respiratori legați de membrană (Nar) și reductazele de nitrați disimilatori periplasmici (Nap). Toate trei aparțin familiei de proteine DMSO reductază și conțin cofactorul bis-molibdopterin guanine dinucleotide (MGD) (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). Genomul B. subtilis codifică numai nitrat reductaza respiratorie nar. Enzimele Nar sunt de obicei compuse din trei subunități. Subunitatea mare NarG conține situsul activ cu cofactorul MGD, o subunitate solubilă mai mică NarH adăpostește unul și trei centre, iar subunitatea NarI este un citocrom b. Nar este o chinol oxidază și piscina menaquinol este oxidată de subunitatea citocromului B NarI. Doi electroni curg prin heme B din NarI către grupurile de fier-sulf din NarH și în cele din urmă către subunitatea citoplasmatică NarG care reduce nitratul la nitrit. Proteina NarJ nu face parte din enzimă, ci este necesară pentru asamblarea finală a enzimei legate de membrană (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian și colab., 2010). Datorită diferitelor situsuri pentru oxidarea chinolului în periplasmă și pentru reducerea nitratului în citosol, nitrat reductaza nar contribuie la generarea unui gradient de protoni (Fig. 5.1). Locusul nar constă din operonul narGHJI (care codifică reductaza nitratului respirator), narK (pentru o proteină potențială de extrudare a nitriților), cadrul de citire deschis ywiC (cu funcție necunoscută), arfm care codifică modulatorul respirației și fermentației anaerobe și, de asemenea, gena pentru regulatorul anaerob Fnr (Cruz-Ramos și colab., 1995; Kunst și colab., 1997).

nitritul este apoi transformat în amoniac de către nitritul reductază asimilator NasDE (Cruz-Ramos și colab., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann și colab., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Nitrit reductaza dependentă de NADH sau producătoare de amoniu este o enzimă care conține siroheme care catalizează reducerea cu șase electroni a nitritului în amoniu. Genele nitrit reductazei nasDE au făcut parte dintr-un operon nasDEF și s-au găsit imediat în aval de operonul nasBC, care codifică reductaza azotată dependentă de NADH (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa și colab., 1995).