rezumat

Mioepiteliul este prezent în tumorile mamare canine sub formă de celule interstițiale suprabazale și proliferative și fus și stelate. Scopul lucrării a fost de a evalua un panel de markeri pentru identificarea a patru tipuri morfologice de celule mioepiteliale diferite în glanda mamară normală și neoplazică și de a investiga modificările imunohistochimice de la un fenotip epitelial la unul mezenchimal. Citokeratina 19 (CK19), citokeratina 5/6 (CK5/6), citokeratina 14 (CK14), receptorul de estrogen (ER), proteina p63, vimentina (VIM) și anticorpii actinei musculare netede (Alfa-SMA) au fost utilizați pe 29 de neoplasme (3 tumori mioepiteliale benigne și 3 maligne, 7 carcinoame în tumori mixte benigne și 16 carcinoame complexe) și pe țesutul normal al glandelor mamare. Toți acești anticorpi au fost testați și pe 3 țesuturi mamare de la animale fără patologie mamară. Markerii mioepiteliali au fost bine exprimați în celulele suprabasale și s-au pierdut treptat în tipurile Mobile, celulele stelate menținând doar expresia VIM tipică mezenchimului. Er etichetate unele celule mioepiteliale de odihnă și motile. Pe baza rezultatelor noastre, propunem o tranziție de la celulele imotile mioepiteliale la celule asemănătoare fibroblastelor migratoare. Această tranziție și caracterizarea unui panou imunohistochimic pentru celulele mioepiteliale în repaus și motile aruncă mai multă lumină asupra comportamentului biologic al celulelor mioepiteliale.

1. Introducere

tumorile glandelor mamare ale câinilor sunt formate atât din componente epiteliale (epiteliu și mioepiteliu), cât și din componente mezenchimale. Originea celulelor mezenchimale este încă dezbătută. Frecvența crescută a tumorilor care prezintă proliferarea celulelor mioepiteliale sau bazale este o caracteristică unică a tumorilor mamare canine .

în glanda mamară normală, lumina este delimitată de un strat interior de celule epiteliale polarizate care se sprijină pe două straturi exterioare sau bazale de celule epiteliale și mioepiteliale . Atât celulele bazale, cât și celulele mioepiteliale sintetizează membrana bazală a canalelor și alveolelor și formează o barieră structurală între celulele epiteliale luminale și stroma înconjurătoare . În conducte, celulele mioepiteliale formează un strat aproape continuu de celule orientate paralel cu axa lungă a conductelor. Acest strat înconjoară celulele epiteliale luminale și le separă de membrana bazală și de stroma. În Alveole, celulele mioepiteliale sunt discontinue, formând o rețea asemănătoare coșului în jurul alveolelor, permițând unor celule epiteliale luminale să contacteze direct membrana bazală . Prin urmare, mioepiteliul nu este situat doar într-o poziție ideală pentru a comunica între aceste două compartimente, dar este, de asemenea, poziționat pentru a furniza semnale de reglementare importante pentru menținerea structurii celulare normale .

pe baza imunohistochimiei, cele trei straturi de celule ale glandei mamare normale prezintă markeri diferiți: epiteliul luminal este marcat de CK19, iar celulele bazale și celulele mioepiteliale sunt colorate de CK5/6 și CK14 și p63, Alfa-SMA și VIM . Celulele mioepiteliale sunt elemente contractile care prezintă un imunoprofil combinat epitelial și muscular neted. Markerii menționați mai sus sunt exprimați în citoplasmă, cu excepția p63 care este un marker nuclear . Stratul celular mioepitelial este singura sursă de supresor tumoral p63, care este inhibat semnificativ asupra proliferării și invaziei celulelor tumorale asociate . În plus , celulele mioepiteliale bazale din glanda mamară normală sunt etichetate ocazional de anticorpul ER, Care este utilizat pentru clasificarea moleculară a tumorilor mamare canine .

Morfologiile celulare mioepiteliale distincte pot fi recunoscute în tumorile complexe și mixte canine: celule mioepiteliale suprabazale de repaus și proliferative și celule mioepiteliale interstițiale motile și stelate. Celulele suprabasale sunt situate între membrana bazală și epiteliul luminal și prezintă fus aplatizat (celule de repaus) sau morfologii poligonale (celule proliferative). Celulele interstițiale sunt aranjate frecvent în cuiburi solide atașate elementelor epiteliale sau izolate în interstițiu . Fusul și celulele mioepiteliale stelate se diferențiază spre un fenotip contractil mai general .

celulele mioepiteliale interstițiale pot deveni în cele din urmă celule asemănătoare fibroblastelor, prezentând doar imunoreactivitate VIM . Diferențierea mioepitelială poate culmina cu formarea diferitelor țesuturi mezenchimale, inclusiv cartilajul și osul în tumora mixtă mamară canină.

dobândirea caracteristicilor tipice ale celulelor mezenchimale este probabil să provină prin tranziția epitelial-mezenchimală (EMT). EMT este un fenomen biologic care permite unei celule epiteliale polarizate, care interacționează în mod normal cu membrana bazală prin suprafața sa bazală, să sufere multiple modificări biochimice care să îi permită să-și asume trăsăturile și funcțiile celulelor mezenchimale .

această lucrare se va concentra asupra diferitelor aspecte ale celulelor mioepiteliale și tumorilor mamare la câini, în special (1) caracterizarea celor patru tipuri morfologice de celule mioepiteliale diferite în glanda mamară normală și neoplazică folosind un panou de anticorpi și (2) modificările imunohistochimice ale celulelor mioepiteliale de la un fenotip epitelial la unul mezenchimal.

2. Materiale și metode

2.1. Probele

probele de glandă mamară a 29 de femele au fost preluate din Baza de date a serviciului anatomopatologic al Facultății de Medicină Veterinară din Bologna. Subiecții au aparținut rase diferite: corcitura (𝑛=13), ciobanesc German (𝑛=3), Pudel (𝑛=3), Yorkshire Terrier (𝑛=3), Teckel (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Indicatorul (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), și Husky Siberian (𝑛=1); toate au fost femei, cu o medie de vârstă de 9.20±2.28 ani (medie ± SD). Tumorile au constat din: 3 tumori mioepiteliale benigne, 3 tumori mioepiteliale maligne, 7 carcinoame în tumori mixte benigne și 16 carcinoame complexe (ultimele două grupuri au fost diferențiate prin prezența cartilajului și/sau osului în tumorile mixte). În plus, au fost evaluate 29 de exemplare din glandele mamare normale din aceeași linie tumorală și 3 probe mamare de la 3 câini femele sănătoși care nu poartă tumori.

tumorile au fost clasificate conform Misdorp și colab. și Goldschmidt și colab. în tumori mioepiteliale benigne: un neoplasm rar compus din celule mioepiteliale dispuse în mănunchiuri scurte amestecate cu un material bazofil fibrilar extracelular; tumori mioepiteliale maligne: diferite de varianta benignă cu celule mioepiteliale mai polimorfe; carcinom complex: un carcinom compus din ambele componente epiteliale luminale și mioepiteliale; carcinom în tumoră benignă: o tumoare cu focare de celule epiteliale care apar maligne sau noduli distincți ai unor astfel de celule care apar împreună cu celule mezenchimale care au produs cartilaj și/sau os posibil în combinație cu țesut fibros.

2.2. Imunohistochimie

au fost tăiate patru secțiuni cu o grosime de o mie de centimetri din blocuri de parafină fixate cu formalină, conținând probe tumorale reprezentative. Imunohistochimia pentru următorii markeri a fost făcută pe aceste țesuturi: CK19, ER, CK5 / 6, CK14, VIM, Alfa-SMA, p63.secțiunile au fost deparaxate în toluen și rehidratate. Peroxidaza endogenă a fost blocată prin imersie în peroxid de hidrogen 0,3% timp de 20 min. Secțiunile au fost apoi clătite în tamponul Tris. Recuperarea antigenului a fost efectuată cu tampon citrat (2,1 g acid citric monohidrat/litru apă distilată), pH 6,0 (cu excepția CK5/6 și ER, care au utilizat EDTA, pH 8,0) și încălzire timp de două perioade de 5 minute într-un cuptor cu microunde la 750 W, urmată de răcire la temperatura camerei timp de 20 min. Anticorpii primari sunt rezumați în tabelul 1. Toți anticorpii primari au fost incubați peste noapte la 4 c, urmați de o tehnică comercială streptavidin-biotin-peroxidază (Lsab Kit, Dako, Amsterdam, Olanda). Diaminobenzidina (0,05% timp de 10 minute la temperatura camerei) a fost utilizată ca cromogen. Diapozitivele au fost contracarate cu Hematoxilina lui Papanicolaou.

ca martor negativ, anticorpul primar a fost înlocuit cu un anticorp irelevant, potrivit izotipului, pentru a controla legarea nespecifică a anticorpului secundar. Controalele tisulare pozitive folosind aceleași protocoale IHC au inclus glanda mamară normală canină (anticorpi anti-ck19, -ER, -CK14, -VIM, Alpha-SMA, -p63) și pielea canină (anti-CK5/6).

Numărul de celule pozitive de către fiecare marker a fost calculat semiquantitativ: − = fără celule pătate, XV = mai puțin de 5% celule pozitive, + = 5-50% celule pozitive, ++ = mai mult de 50% celule pozitive. Cazurile au fost considerate pozitive pentru ER atunci când s-a observat colorarea nucleară în cel puțin 5% celule tumorale .

3. Rezultate

patru tipuri de celule mioepiteliale au fost recunoscute pe baza morfologiei lor. Subtipul de repaus a prezentat caracteristicile alungite ale celulelor fusului în contact strâns cu celulele epiteliale luminale, precum și celulele suprabasale proliferante care au prezentat în schimb o formă poligonală (Figura 1(a)). Celulele Mobile interstițiale au fost observate atât formând cuiburi (cuiburile căptușite de tip fus, cât și celulele stelate constituind miezul cuibului) și izolate în interstițiu (Figura 2(a)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

figura 1

celule mioepiteliale suprabasale: celule de repaus (săgeți subțiri) și celule proliferative (săgeți groase). Expresia imunohistochimică a unui panou de anticorpi aplicați de IHC, 63x (a) hematoxilină-eozină; (b) anticorpi anti-CK19 care etichetează citoplasma; (c) anticorpi anti-ER care etichetează nucleele; (d) anticorpi anti-CK 5/6 care etichetează citoplasma; (e) anticorpi anti-ck14 care etichetează citoplasma; (f) anticorpi anti-VIM care etichetează citoplasma; (g) anticorpi anti-Alfa-SMA care etichetează membrana citoplasmatică; (h) anticorpi anti-p63 care etichetează nucleele.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anticorpi anti-VIM care etichetează citoplasma; (g) anticorpi anti-Alfa-SMA care etichetează membrana citoplasmatică; (h) anticorpi anti-p63 care etichetează nucleele.

3.1. Glanda mamară normală

în cele 3 cazuri de control, toate celulele mioepiteliale suprabazale în repaus și proliferative au fost marcate de p63, CK14, Alfa-SMA și VIM. Celulele mioepiteliale suprabazale de repaus și proliferative nu au exprimat CK19 în niciunul dintre cazuri.

3.2. Țesutul mamar din aceeași linie a tumorii mamare

în cele 29 de țesuturi normale din aceeași linie cu tumorile, toate celulele mioepiteliale suprabazale și proliferative au fost etichetate de p63, CK14, Alfa-SMA și vim. CK5 / 6 a fost pozitiv în toate cazurile, cu excepția a patru, iar ER a fost detectat în 12 cazuri. Expresia CK19 a fost observată numai în epiteliul luminal. Nu au fost observate celule interstițiale motrice mioepiteliale. Toate rezultatele sunt rezumate în tabelul 2.

3.3. Tumorile mamare

rezultatele imunohistochimice pentru suprabasal (Figura 1) și celulele motile (Figura 2) folosind p63, CK14, CK5/6, CK19, Alfa-SMA, VIM și ER sunt rezumate în tabelul 2. CK5 / 6 marcat: celule de repaus suprabasal în 16 din cele 29 de cazuri (5 carcinoame în tumori mixte benigne și 11 carcinoame complexe). CK 5/6 a marcat, de asemenea, celule proliferative suprabasale și fus motile în 10 cazuri (3 carcinoame în tumori mixte benigne și 7 carcinoame complexe). Celulele motile stelate au fost prezente în 25 de cazuri (1 tumoră mioepitelială benignă, 3 tumori mioepiteliale maligne, 5 carcinoame în tumori mixte benigne și 15 carcinoame complexe), dar au fost negative pentru CK5/6. Cartilajul în tumorile mixte mamare a fost întotdeauna negativ.

CK14 a prezentat pozitivitate în 23 de cazuri în celulele de repaus (cu excepția a 1 carcinom complex și a tumorilor mioepiteliale benigne și maligne), în 22 de cazuri în celulele proliferative (6 carcinoame în tumori mixte benigne și 15 carcinoame complexe) cu tendința de a pierde expresia atunci când aceste celule au dobândit fenotipul mai motil al celulelor fusului (pozitiv în 2 tumori mioepiteliale benigne și 3 maligne, 2 carcinoame în tumori mixte benigne și 2 carcinoame complexe). Condrocitele tumorilor mixte au fost negative.

VIM a fost pozitiv în celulele suprabasale în cele 23 de cazuri de carcinom în tumori benigne și carcinom complex și în celulele mioepiteliale mobile în toate cele 29 de cazuri. Celulele stromale au fost pozitive în toate cazurile. Cartilajul a fost VIM pozitiv în toate cele 7 carcinoame din tumorile mixte benigne.

Alfa-SMA marcat de repaus și proliferative celule mioepiteliale suprabasale în 23 carcinoame în tumori mixte benigne și carcinoame complexe. Celulele fusului în 10 cazuri (5 carcinoame în tumori mixte benigne și 5 carcinoame complexe) au prezentat pozitivitate pentru Alfa-SMA. În fiecare caz, cu excepția a două carcinoame complexe, celulele stelate au fost negative. Stroma a arătat pozitivitate în doar 6 cazuri (1 carcinom în tumori mixte benigne și 5 carcinoame complexe).

P63 a fost detectat în celulele mioepiteliale suprabazale de repaus și proliferative din cele 23 de cazuri de carcinom în tumori mixte benigne și carcinom complex. Toate celulele fus și stelate au fost negative. Celulele stromale și cartilajul au fost negative.

expresia ER a fost prezentă în 11 celule mioepiteliale suprabasale (4 carcinoame în tumori mixte benigne și 7 carcinoame complexe); celulele motrice axiale și stelate au fost pozitive în 9 cazuri (3 carcinoame în tumori mixte benigne și 6 carcinoame complexe). Cartilajul tumorilor mixte a fost negativ.

celulele mioepiteliale mobile de repaus și proliferative suprabasale și fus / stelate nu au exprimat CK19 în niciuna dintre tumorile examinate. Cartilajul tumorilor mixte a fost, de asemenea, negativ pentru CK19.

4. Discuție

pe baza constatărilor Gama și colab. și Tateyama și colab. , patru tipuri morfologice de celule mioepiteliale sunt prezente în glanda mamară: celulele mioepiteliale suprabazale de repaus și proliferative căptușesc alveolele și conductele și celulele motrice interstițiale fus și stelate, care se află în spațiul interstițial unde pot fi aranjate în cuiburi. Markerii mioepiteliali, cum ar fi p63, CK5/6, CK14, Alfa-SMA și VIM, s-au dovedit a fi adjuvanți de diagnostic valoroși pentru a facilita evaluarea proliferărilor complexe și mixte. CK19 este considerat markerul standard de aur pentru epiteliul luminal și a fost utilizat pentru a evita orice diagnostic greșit cu celule mioepiteliale. Din cauza modelelor de reactivitate încrucișată și a faptului că focarele lezionale sunt de obicei minute, niciunul dintre markerii mioepiteliali nu s-a bucurat de sensibilitate și specificitate 100% pentru celulele mioepiteliale. Ca atare, cel puțin 2 markeri ar trebui utilizați pentru a evalua orice focalizare dată .

pe baza rezultatelor noastre, cel mai bun marker pentru celulele suprabasale a fost p63 în special în asociere cu CK14, care a fost limitat la celulele mioepiteliale mature (bazale) și, într-o măsură mai mică, urmate de CK5 / 6, Alfa-SMA și VIM (Figura 1). Cu toate acestea, CK5/6 a marcat, de asemenea, celule epiteliale luminale, ceea ce face dificilă distingerea acestora de celulele mioepiteliale proliferative suprabasale . Din punct de vedere morfologic, celulele epiteliale și mioepiteliale pot avea o formă poligonală. O caracteristică atât a CK14, cât și a CK5/6, dar nu a p63, Alfa-SMA și VIM, a fost expresia lor redusă în celulele mioepiteliale în starea proliferativă suprabasală. Expresia CK14, CK5/6 și p63 s-a pierdut treptat în celulele din fusul și starea motilă stelată.

Alfa-SMA și VIM au fost prezente în celulele mioepiteliale motile ale fusului cu grade diferite de intensitate. Numai VIM s-a dovedit a fi un marker consistent pentru celulele mioepiteliale stelate. În acest studiu, mioepiteliul mobil stelat a fost aranjat în cuiburi și căptușit de celule în repaus, probabil de origine alveolară. Această caracteristică poate susține ideea că cuiburile celulelor mioepiteliale motile stelate, care și-au pierdut expresia principalilor markeri suprabasali mioepiteliali, dar au păstrat afinitatea pentru VIM, sunt precursorii cartilajului, indicând faptul că aceste celule și-au finalizat transformarea în elemente mezenchimale. În tumorile mioepiteliale benigne și maligne, etichetarea VIM în toate cazurile, pierderea tuturor celorlalți markeri mioepiteliali suprabasali și pozitivitatea redusă la CK14 în celulele fusului au indicat o expresie predominantă a stării motile mioepiteliale și o posibilă trecere de la celule mioepiteliale simple la fibroblaste mezenchimale.

în studiul nostru, dovada trecerii celulelor mioepiteliale la un fenotip mezenchimal, arătată prin pierderea expresiei ck14, CK5 / 6 și P63, a fost întărită de etichetarea discontinuă a celulelor fusului pentru Alfa-SMA, un marker atât al celulelor mioepiteliale, cât și al miofibroblastelor, care s-a pierdut complet în celulele motile stelate care se presupune că au devenit fibroblaste.

studii suplimentare de confirmare de către Tsuda și colab. a raportat apariția miofibroblastelor cu resturi de Expresie CK14 (descrise ca „celule mioepiteliale convertite”). În cazurile examinate în studiul de față, CK14 a dispărut progresiv, indicând astfel o pierdere a fenotipului (mio-)epitelial. Aceste rezultate susțin ipoteza EMT care implică o stare asemănătoare mioepiteliului, care suferă o tranziție mezenchimală mioepitelială (MMT). Această ipoteză a fost confirmată la câine de G Inkrtner și colab. OMS a declarat că în tumorile mamare unul dintre pașii în evoluția celulelor mezenchimale implică expresia trăsăturilor mioepiteliale tipice.

un rezultat interesant al studiului de față a fost pozitivitatea la ER Găsită în 12/29 celule mioepiteliale suprabasale și 9/29 celule stelate de carcinom în tumori mixte benigne și carcinoame complexe. Au fost descrise două izoforme ale receptorilor ER, și anume, er-VIII și er-VIII, aceasta din urmă fiind singura formă exprimată în nucleele celulelor bazo-mioepiteliale izolate . Anticorpul utilizat în prezenta investigație a inclus ambele izoforme: atât celulele luminale, cât și cele bazale/stelate au fost etichetate, probabil celulele luminale prin er-inktiv și celulele bazale/stelate prin er-inktiv.

În concluzie, celulele mioepiteliale suprabasale au fost bine caracterizate de p63 și CK14 și într-o măsură mai mică de celălalt marker utilizat. Celulele mioepiteliale motile sunt în schimb caracterizate prin Alfa-SMA și VIM și pierderea CK14, CK5/6 și p63 (Figura 2). Studiul de față a demonstrat, de asemenea, ER atât în celulele epiteliale luminale, cât și în celulele mioepiteliale suprabasale/stelate (acestea din urmă în aproximativ jumătate din cazuri) și că expresia ER nu este influențată de faza de repaus/motilă. Prin urmare, în secțiuni seriale sau cu mai multe straturi, imunohistochimia la ER în combinație cu p63 și CK14 poate servi la evitarea identificării eronate a celulelor luminale sau mioepiteliale în tumorile mamare canine. Tendința expresiei Alfa-SMA și VIM conservate în celulele fusului și numai pozitivitatea VIM în celulele motile stelate, precum și scăderea expresiei p63 în ambele tipuri de motile, susține ipoteza EMT care implică o stare asemănătoare mioepiteliului în MMT. Celula motilă a fusului ar putea fi considerată o transformare mai timpurie decât celula stelată către un fenotip mezenchimal.

contribuția autorilor

acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Conflict de interese

autorii declară că nu au interese concurente.

recunoaștere

autorii îi mulțumesc doamnei Anne Collins pentru editarea textului în limba engleză.

materiale suplimentare