2. O poveste despre parabioză

afirmația că sângele ne poate întineri organele a fost revitalizată de un grup de cercetare de la școala de Medicină a Universității Stanford în 2005 și 2010 . Aceste studii au rezultat din observații care arată că capacitatea regenerativă a țesuturilor scade odată cu vârsta. În țesuturi precum mușchi, sânge, ficat și creier, acest declin a fost atribuit unei reacții diminuate a celulelor stem și progenitoare specifice țesutului . Cu toate acestea, mușchiul îmbătrânit se regenerează cu succes atunci când este grefat în mușchi la o gazdă tânără, dar mușchiul tânăr prezintă o regenerare afectată atunci când este grefat într-o gazdă în vârstă . Factorii locali sau sistemici ar putea fi responsabili pentru aceste efecte reciproce. Pentru a testa dacă factorii sistemici pot susține regenerarea țesuturilor la animalele tinere și/sau pot inhiba regenerarea la animalele vechi, lucrarea lui Conboy și colegii din 2005 a raportat o configurație experimentală în care – spre deosebire de transplant – țesuturile regenerante la animalele în vârstă sunt expuse numai la factorii circulanți ai animalelor tinere și invers . Astfel, au stabilit perechi parabiotice între șoareci tineri și bătrâni (parabioze heterocronice), cu perechi parabiotice între doi șoareci tineri sau doi șoareci bătrâni (parabioze izocronice) care servesc drept controale (Fig. 1). În parabioză, doi șoareci sunt uniți chirurgical, astfel încât dezvoltă o circulație sanguină comună cu schimb rapid și continuu de celule și factori solubili la niveluri fiziologice prin sistemul lor circulator comun . Parabioza a fost inventată în 1864 de fiziologul Paul Bert pentru a vedea dacă a fost creat un sistem circulator comun. Clive McCay, biochimist și gerontolog la Universitatea Cornell din Ithaca, New York, a fost primul care a aplicat parabioza studiului îmbătrânirii, dar această tehnică a căzut din favoare după anii 1970, probabil pentru că mulți șobolani au murit din cauza unei afecțiuni misterioase numită boală parabiotică, care apare la aproximativ una până la două săptămâni după ce partenerii sunt uniți și poate fi o formă de respingere a țesuturilor. Abia la începutul secolului XXI, Irving Weissman și Thomas A. Rando de la Universitatea Stanford au readus parabioza la viață, pentru a studia mișcarea și soarta celulelor stem din sânge.

parabioză. Doi șoareci sunt cusute împreună împărtășind un flux sanguin comun. Parabioza heterocronică este atunci când un șoarece tânăr este alăturat chirurgical partenerilor în vârstă, în timp ce parabioza izocronică se referă la perechi de animale tinere-tinere sau bătrâne. Modificat din ref. cu permisiunea Nature Publishing Group.

grupul Stanford a investigat regenerarea musculară și proliferarea celulelor hepatice în setarea parabiozei. După leziuni musculare, regenerarea musculară a fost studiată prin formarea de miotuburi care exprimă lanțul greu de miozină embrionară, un marker specific al regenerării miotuburilor la animalele adulte. La cinci zile după leziune, mușchii la animalele tinere, atât în parabiozele izocronice, cât și în cele heterocronice, s-au regenerat puternic. În schimb, mușchiul rănit de la parabionții izocronici Vechi s-a regenerat slab. În special, parabioza cu șoareci tineri a îmbunătățit semnificativ regenerarea musculară la partenerii vechi. Regenerarea mușchilor în vârstă s-a datorat aproape exclusiv activării celulelor progenitoare rezidente, în vârstă, și nu încorporării celulelor progenitoare circulante de la parteneri tineri (după cum se apreciază prin prezența a mai puțin de 0,1% din celulele care exprimă proteine fluorescente verzi derivate de la parteneri tineri transgenici pentru GFP). Deoarece pierderea regenerării musculare odată cu vârsta se datorează parțial unei afectări legate de vârstă în reglarea up a ligandului Delta după leziuni musculare , a fost studiată și expresia Delta. În special, celulele satelit de la partenerii în vârstă ai parabionților heterocronici au arătat o reglare marcată a Delta, comparabilă cu cea găsită la partenerii lor tineri și la șoarecii tineri care nu au fost supuși împerecherilor parabiotice (Fig. 2).

îmbătrânirea mușchilor, ficatului și creierului la șoareci bătrâni și întinerirea prin parabioză heterocronică. Regenerarea musculaturii scheletice la rănire este legată de reglarea în sus a Deltei ligandului, care se pierde odată cu vârsta (panourile superioare). Proliferarea hepatocitelor la animalele tinere se corelează cu scăderea complexului cebp-VIII-brahma (cebp-VIII-Brm) comparativ cu șoarecii în vârstă (panouri medii). În timp ce animalele tinere își pot crește neurogeneza și angiogeneza în zona subventriculară a creierului, unde sunt prezente celule stem neuronale, animalele în vârstă nu pot (panouri inferioare). În principiu, parabioza heterochonică returnează toate semnele fenotipice și moleculare ale îmbătrânirii prin transferul factorilor și celulelor solubile.

în cazul studiilor hepatice și ca în mușchi, în timp ce proliferarea celulelor albuminei pozitive la parabionții izochonici vechi a fost mai mică decât cea observată la parabionții izochonici tineri, parabioza la un partener tânăr a crescut semnificativ proliferarea hepatocitelor la șoarecii în vârstă. Ca și în mușchi, creșterea proliferării hepatocitelor la șoarecii în vârstă s-a datorat celulelor rezidente și nu grefării celulelor circulante de la parteneri tineri. Declinul proliferării celulelor progenitoare hepatocitare se datorează formării unui complex care implică cebp-implicent și factorul de remodelare a cromatinei brahma (Brm) care inhibă expresia genică condusă de E2F . În paralel cu efectul asupra regenerării hepatocitelor, s-a depistat formarea complexului cebp-XV-Brm la ficat de la parabionții heterocronici vechi, dar nu și de la cei izocronici tineri, iar complexul a fost diminuat la parabionții heterocronici vechi (Fig. 2). În cele din urmă, în mușchi și ficat, au observat o reducere a proliferării celulelor progenitoare la șoarecii tineri după asocierea parabiotică cu șoarecii bătrâni, sugerând că șoarecii bătrâni sunt îmbogățiți cu factori inhibitori care sunt diluați la parabioză. În general, aceste date au indicat că există factori sistemici care pot modula căile de semnalizare moleculară critice pentru activarea sau inhibarea celulelor progenitoare specifice țesutului și că mediul sistemic al unui animal tânăr este unul care promovează regenerarea cu succes, în timp ce cel al unui animal mai în vârstă nu reușește să promoveze sau inhibă activ regenerarea tisulară cu succes. În cele din urmă, această lucrare a demonstrat, de asemenea, că celulele stem/progenitoare specifice țesuturilor își păstrează o mare parte din potențialul lor proliferativ intrinsec chiar și atunci când sunt vechi, dar că schimbările legate de vârstă în mediul sistemic și/sau nișa în care locuiesc celulele progenitoare, împiedică activarea completă a acestor celule pentru regenerarea tisulară productivă.

în lucrarea din 2010, Wagers și colegii săi au încercat să-și dea seama care este rolul factorilor locali de nișă și sistemici de micro-mediu în îmbătrânirea celulelor stem și progenitoare hematopoietice (HSPCs), folosind sistemul parabiotic de șoarece in vivo și studiind frecvența HSC și numărul de HSC-uri pe termen lung (LT-HSCs). Markerii congenici au fost utilizați pentru a distinge HSC-urile de partenerii în vârstă față de cei tineri. Îmbătrânirea este însoțită la nivelul măduvei osoase de o extindere considerabilă a HSPCs cuplată paradoxal cu o capacitate redusă de reconstituire a sângelui și un potențial de diferențiere înclinat după transplant . Parabionții heterocronici în vârstă au prezentat o reducere semnificativă a LT-HSC, care s-a apropiat de nivelurile normale de tinerețe. În special, acest efect a apărut ca urmare a schimbărilor în populația HSC în vârstă și nu a traficului de celule tinere către măduva partenerilor în vârstă. Mai mult, parabioza heterocronică a indus, de asemenea, recuperarea funcției LT-HSC la șoarecii în vârstă, evidențiată prin potențialul de grefare și restabilirea raporturilor tinerești ale limfoidului B la celulele mieloide. Ca și în cazul HSCs, atât frecvența, cât și numărul total de celule de nișă osteoblastice izolabile de la șoareci în vârstă au fost crescute comparativ cu grupurile de control tinere. Experimentele in vitro de interacțiune între celulele măduvei osoase tinere cu celule de nișă osteoblastică în vârstă care prezintă, de asemenea, extinderea HSCs, au sugerat că efectele de întinerire HSC ale parabiozei heterochronice apar indirect – prin revenirea modificărilor legate de vârstă în celulele de nișă osteoblastice. Într-adevăr, frecvența și numărul osteoblastelor au fost restabilite la niveluri tinere atunci când animalele în vârstă au experimentat în parabioză heterochonică un mediu sistemic tânăr. Mai mult, celulele de nișă izolate din parabioza heterocronică în vârstă au prezentat o capacitate semnificativ redusă de a provoca acumularea HSPC, spre deosebire de celulele de nișă din parabioza izocronică în vârstă. Interesant este că celulele de nișă osteoblaste izolate de la parabionții heterocronici tineri au indus o ușoară expansiune a Hspc-urilor tinere în comparație cu cele de la parabionții izocronici tineri. Aceste studii in vitro au sugerat un efect reciproc al mediului circulator îmbătrânit asupra activității de nișă la tinerii parteneri heterocronici și indică faptul că semnalele sistemice restabilesc nișele îmbătrânite. Au fost efectuate experimente suplimentare, menite să evalueze capacitatea tinerilor Hspc de a reconstitui hematopoieza. Rezultatele au demonstrat că, similar cu funcția de grefare afectată a HSC-urilor în vârstă naturală , Hspc-urile tinere expuse in vitro la celulele niched-izocronice în vârstă au prezentat o capacitate redusă de reconstituire hematopoietică. Acest lucru indică faptul că interacțiunea cu celulele de nișă osteoblastice în vârstă este suficientă pentru a induce defecte ale funcției HSC. Cu toate acestea, celulele de nișă heterocronice în vârstă nu au modificat activitatea de reconstituire a HSC-urilor tinere. Împreună, aceste date au demonstrat că modificările funcționale induse de vârstă în celulele de nișă de reglementare HSC pot fi inversate de factorii circulanți tineri. În general, aceste constatări sugerează în continuare că efectele de întinerire ale unei circulații tinere asupra HSC sunt comunicate indirect – prin semnalizarea de la celulele de nișă osteoblastice întinerite.pentru a înțelege ce factor este implicat în reglarea funcției celulelor de nișă, autorii au căutat să investigheze dacă factorul de creștere asemănător insulinei-1 (IGF-1) ar putea juca un rol. IGF – 1 s-a dovedit a fi un regulator de îmbătrânire și longevitate conservat evolutiv . Experimentele in vitro și in vivo au demonstrat că IGF-1 local, nu sistemic, pare să inducă îmbătrânirea celulelor de nișă reglatoare HSC și că neutralizarea semnalizării IGF-1 în micromediul măduvei osoase revine la modificările legate de vârstă în celulele de nișă osteoblastice care afectează reglarea adecvată a HSCs.

În general, aceste constatări au sugerat că, în timp ce în condiții tinere, celulele de nișă osteoblastice promovează menținerea celulelor stem homeostatice, acestea sunt modificate prin îmbătrânire, astfel încât să permită acumularea sporită a HSC-urilor disfuncționale. Aceste modificări specifice vârstei în celulele de nișă par a fi semnalate de factori circulanți necaracterizați care acționează parțial prin modificarea semnalizării IGF-1 în celula de nișă (Fig. 3). Este probabil ca IGF-1 Să nu aibă un rol major pentru toate țesuturile îmbătrânite, deoarece în timp ce rolul său în nișa osteoblastică este promovarea vârstei, spre deosebire de mușchii scheletici expresia locală a IGF-1 menține capacitatea regenerativă la animalele în vârstă.

în octombrie 2010, trei dintre cei patru autori, inclusiv Amy J. Pariuri, a retras această lucrare, în special pentru rolul celulelor de nișă osteoblastice în întinerirea HSCs la șoarecii în vârstă . S-a constatat că primul autor a manipulat imaginile pentru nodulii osoși formați în celule de nișă osteoblastică de la șoareci tineri și în vârstă (Retraction Watch, http://retractionwatch.com/2012/08/29/ori-finds-harvard-stem-cell-lab-post-doc-mayack-manipulated-images/). Astfel, ar trebui obținută o confirmare suplimentară cu privire la problema sa, având în vedere, de asemenea, că modelul parabiozei a fost exploatat pentru studierea întineririi altor organe vechi. Într-adevăr, au apărut ulterior două lucrări care arată că expunerea unui șoarece tânăr la un mediu sistemic vechi poate inhiba miogeneza și neurogeneza .

în 2013, echipa condusă de Amy J. Wagers, a publicat o altă lucrare prin care au demonstrat folosind modelul parabiozei, că hipertrofia cardiacă legată de vârstă poate fi inversată prin expunerea la un mediu circulator tânăr cu doar 4 săptămâni de parabioză . Măsurarea tensiunii arteriale și a nivelurilor circulante de angiotensină II și aldosteron în diferitele grupuri a demonstrat clar că inversarea hipertrofiei cardiace la șoarecii vârstnici expuși la o circulație tânără nu a putut fi explicată printr-o simplă reducere a tensiunii arteriale sau prin modularea efectorilor cunoscuți ai tensiunii arteriale la șoarecii mai în vârstă. Interesant este că parabioza heterochronică nu a indus modificări ale raportului greutate-tibie, dimensiunea cardiomiocitelor sau tensiunii arteriale la șoarecii tineri uniți cu partenerii în vârstă. Aceste date au implicat un factor antihipertrofic produs de șoareci tineri (mai degrabă decât diluarea unui factor de prohipertrofie produs de șoareci bătrâni) în remodelarea cardiacă indusă de parabioză heterocronică. În „parabioza falsă”, prin care șoarecii sunt uniți chirurgical lăsând pielea intactă, astfel încât să nu dezvolte o circulație comună, nu s-a găsit nicio diferență semnificativă în raportul dintre greutatea inimii și lungimea tibiei la șoarecii în vârstă, indicând în continuare că circulația încrucișată și schimbul de factori transmiși de sânge sunt necesari pentru inversarea hipertrofiei cardiace legate de vârstă. Pentru a identifica acești factori, o analiză proteomică la scară largă utilizând tehnologia bazată pe aptamer a dezvăluit 13 analiți care distingeau în mod fiabil șoarecii tineri de șoarecii bătrâni. Unul dintre acești candidați, factorul de diferențiere a creșterii 11 (GDF11), membru al superfamiliei activin/TGF-XV, a fost confirmat în analize suplimentare. GDF11 a fost redus în plasma șoarecilor izocronici bătrâni comparativ cu șoarecii izocronici tineri și a fost readus la niveluri tinere la șoarecii bătrâni după expunerea la o circulație tânără. Un tratament zilnic de 30 de zile al șoarecilor bătrâni cu GDF11 a dus la o reducere semnificativă a raportului greutate-tibie a inimii în comparație cu grupul de control injectat cu soluție salină. Aceste date au sugerat că cel puțin o componentă patologică a insuficienței cardiace diastolice legate de vârstă este de natură hormonală. Cu toate acestea, regresia observată a hipertrofiei cardiace la șoarecii bătrâni expuși la o circulație tânără este puțin probabil să fie atribuită în întregime reaprovizionării unui singur factor și ar trebui recunoscuți alți factori.două studii ulterioare efectuate de Wagers și colegii săi au descoperit că GDF11 a stimulat creșterea de noi vase de sânge și neuroni în creier și a stimulat celulele stem să regenereze mușchii scheletici la locurile leziunilor . Într-una din aceste lucrări , modelul parabiozei heterocronice de șoarece a evidențiat o creștere a volumului vaselor sanguine cerebrale și a fluxului sanguin ca răspuns la factorii sistemici tineri, împreună cu o auto-reînnoire și diferențiere mai mare în populația de celule stem neuronale din zona subventriculară, aducând o îmbunătățire a discriminării olfactive (Fig. 2). Mai mult, au descoperit că GDF11 ar putea crește volumul vaselor de sânge, precum și neurogeneza la șoarecii bătrâni. Interesant este că sângele de la șoareci în vârstă de 15 luni nu a scăzut populațiile de celule stem neuronale din creierul tânăr, în timp ce sângele mai în vârstă (21 de luni) a provocat un efect dăunător, sugerând că animalele mai în vârstă cresc acumularea de factori sistemici dăunători și/sau factori tineri de protecție mai mici. Pe de altă parte, în lucrarea scrisă de Rando și Tony Wyss-Corey ca oameni de știință seniori, chemokina CCL11/eotaxina a fost identificată ca un factor de sânge legat de vârstă asociat cu scăderea neurogenezei și afectarea învățării și memoriei la șoareci . Ceea ce trebuie determinat este dacă CCL11 interacționează direct cu celulele progenitoare neuronale în timpul îmbătrânirii influențând capacitatea lor de diferențiere sau are acțiuni indirecte prin interacțiuni cu alte tipuri de celule de nișă neurogenă.

în cealaltă lucrare de pariuri și colegi , s-a demonstrat că celulele satelit sortate de la șoareci heterocronici în vârstă au îmbunătățit capacitatea de diferențiere miogenică, precum și deteriorarea ADN-ului mai mică în comparație cu celulele satelit de la controalele izocronice în vârstă. În ceea ce privește reversia hipertrofiei cardiace legate de vârstă , tratamentul șoarecilor în vârstă cu injecții intraperitoneale zilnice de GDF11 recombinant timp de 4 săptămâni a crescut numărul de celule satelit cu ADN intact, comparativ cu celulele de la șoareci în vârstă care au primit vehicul singur. Mai mult, într-un model de leziuni musculare, tratamentul GDF11 al șoarecilor în vârstă cu 28 de zile înainte de rănire și continuat timp de 7 zile după aceea a restabilit profiluri mai tinere de calibru myofiber în regenerarea mușchilor. Șoarecii în vârstă tratați cu GDF11 au prezentat, de asemenea, o rezistență medie crescută la efort și rezistență la prindere.

în această ultimă lucrare, ei au descoperit, de asemenea, că expunerea in vitro a celulelor satelit îmbătrânite la GDF11, dar nu miostatină (un alt membru al superfamiliei TGF-XV) sau TGF-XV1, a produs creșteri receptive la doză în proliferarea și diferențierea celulelor satelit, sugerând că GDF11, spre deosebire de miostatină, poate acționa direct asupra celulelor satelit pentru a-și modifica funcția.