Rolul expresiei Neisseria meningitidis PorA și PorB în susceptibilitatea antimicrobiană | Company Pride
litera
Neisseria meningitidis poate determina o boală sistemică potențial letală. Diagnosticul precoce și intervenția antimicrobiană promptă sunt esențiale pentru rezultatele clinice favorabile. Rezistența la antibiotice a fost raportată pentru peniciline (1), tetraciclină (2) și sulfonamide (3), precum și chinolone (4) și rifampicină (5).
N. meningitidis exprimă două porine majore, PorA și PorB, care sunt variabile antigenic între tulpini și în cadrul unei tulpini, iar PorA este variabilă de fază (comutare aleatorie on/off) (6). Neisseria gonorrhoeae exprimă un singur porin, PorB. Modificările expresiei porinei sau variantei porinelor mediază rezistența la antibiotice în mai multe bacterii Gram-negative, inclusiv N. gonorrhoeae (7,-10). În N. meningitidis, absența PorB crește rezistența la tetraciclină și cefsulodină in vitro (11). Rolul PorA în rezistența antimicrobiană nu a fost raportat pentru meningococ. În plus față de rolul propus în evaziunea imună, am emis ipoteza că expresia Pora variabilă de fază poate oferi un mecanism evident pentru meningococ de a se sustrage antimicrobienelor dacă PorA mediază absorbția sau excluderea antibioticelor. Am generat tulpini lipsite de PorA sau PorB și am efectuat teste MIC. De asemenea, am testat dacă expresia PorA modificată este selectată prin expunerea antimicrobiană pe parcursul testului MIC.
genele porA și porB cu secvențe flancante au fost amplificate din tulpina N. meningitidis MC58 și clonate în pGEM t-easy. PCR invers urmat de auto-ligare a dat plasmide cu ștergeri interne și a introdus site-uri de restricție. Caseta LacZ / kanamycin (12) a fost clonată în situl SmaI introdus alelei Pora șterse, producând plasmidă pPorALacZKan. O genă cloramfenicol acetiltransferază a fost amplificată și clonată în situl bglii introdus alelei porb șterse, în plasmida pPorB:CAT. Construcțiile porA lacZ kan sau porB:: cat s-au transformat în tulpina N. meningitidis int 9 (13) pentru a produce tulpinile int 9 int și int 9 int. Înlocuirea alelică a alelelor Pora sau porB de tip sălbatic cu alela mutantă a fost confirmată prin PCR și secvențiere, precum și prin pagina SDS a proteinelor membranei exterioare extrase de Sarkosil (Fig. 1A).
analiza expresiei porinei în timpul analizei MIC. (A) proteinele membranare au fost izolate prin extracție cu Sarkosil, iar 10 hectogg au fost separate pe 8 până la 12% geluri de acrilamidă bis-Tris înainte de colorarea cu Coomassie. Culoarul 1, circulatia 9, circulatia 2, circulatia 9, circulatia 3, circulatia 9, circulatia nr. (B) probele din ultimul puț care prezintă turbiditate au fost placate pe agar BHI și imunoblotate cu MAB Mn14c11.6 specific PorA.
MIC au fost evaluate prin metoda microdiluției bulionului în plăci cu 96 de puțuri (14) folosind bacterii crescute peste noapte pe agar bhi suplimentat la 37 CTC și agitare subculturată timp de aproximativ 4 ore în bulionul BHI la 37 CTC înainte de ajustarea la aproximativ 5 CTC 105 UFC / ml pe baza densității optice la 600 nm (OD600). După adăugarea a 50 de centicli la antibioticele diluate în serie, CMI au fost înregistrate după creșterea peste noapte la 37 centicli C (Tabelul 1) ca concentrații la care nu s-a observat turbiditate. Fiecare test a fost făcut de trei ori, de fiecare dată în trei exemplare. Pentru fiecare tratament, mic-urile au fost identice în cadrul și între teste.
tabelul 1
microfoane pentru tipul sălbatic și mutantul N. meningitidis strainsa
| Antibiotice | CMI (µg/ml) | ||
|---|---|---|---|
| ¢9 | ¢9ΔPorA | ¢9ΔPorB | |
| Cefotaxim | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 |
| Ceftazidime | 0.03125 | 0.03125 | 0.0625 |
| Cefalotină | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 |
| ampicilină | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 |
| carbenicilină | 0,0625 | 0,0625 | 0,0625 |
| cloxacilină | 1.25 | 1.25 | |
| penicilină G | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 |
| piperacilină | 0.03125 | 0.03125 | 0.015625 |
| tetraciclină | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 |
| doxiciclină | 0.1875 | 0.1875 | 0.375 |
| ciprofloxacină | 0,003125 | 0,003125 | 0.00625 |
| acid nalidixic | 1.25 | 1.25 | 1.25 |
| imipenem | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 |
| Rifampin | 0.125 | 0.125 | 0.0625 |
rezultatele noastre au confirmat că pierderea expresiei meningococice PorB crește rezistența la tetraciclină (11). Mutațiile din PorB contribuie, de asemenea, la rezistența la tetraciclină în N. gonorrhoeae (9, 15). Terapia combinată recomandată pentru N. gonorrhoeae rezistentă la multiplicare include ceftriaxona injectabilă și doxiciclina orală sau azitromicina (16). În acest context, este de remarcat faptul că tulpina mutantă meningococică inktiv 9 inktivporb a avut o sensibilitate redusă la doxiciclină. S-a observat scăderea susceptibilității la cefalotină pentru numărul 9 de cefalosporine, precum și pentru cefalosporinele Cefotaximă și ceftazidimă. Un raport anterior a legat mutația N. meningitidis PorB cu rezistența crescută la cefsulodină (11). În N. variantele gonorrhoeae, porb loop 3 contribuie, de asemenea, la creșterea rezistenței la cefalosporină (17). Confirmarea noastră că Neisseria PorB modulează susceptibilitatea la cefalosporină ridică posibilitatea ca reducerea susceptibilității la această clasă să apară clinic sau să fie facilitată de mutații ale PorB fie la meningococi, fie la gonococi.
utilizarea fluorochinolonei nu mai este recomandată pentru infecția gonococică (18), iar mutațiile punctuale ale PorB1b de N. gonorrhoeae contribuie la scăderea susceptibilității N. gonorrhoeae la ciprofloxacină. Modificările expresiei porinei gonococice modifică rezistența la ciprofloxacină (19); am constatat că mutația PorB meningococică duce, de asemenea, la reducerea sensibilității la ciprofloxacină. În schimb, această tulpină a fost mai susceptibilă la rifampicină, cealaltă alegere majoră pentru profilaxia meningococică, probabil prin arhitectura modificată a membranei, așa cum sa sugerat pentru rezistența modificată la rifamicină a Acinetobacter baumannii rezistent la colistină (20).
în schimb, nu s-au observat modificări ale susceptibilității la un tratament de tip x-x 9 x-x în comparație cu tulpina parentală PorA+ pentru oricare dintre antibioticele testate (Tabelul 1). Acest lucru sugerează că fie PorA nu are un rol direct în intrarea antimicrobienelor în celulă, fie există o selecție pentru o expresie PorA redusă prin variație de fază în timpul testului CMI, fie în tulpina parentală, fie în 7CT-9ct-porb, care poate masca intrarea antibiotică mediată de PorA. Pentru a evalua acest lucru, am izolat bacteriile din puțul final în care s-a observat turbiditatea și s-a evaluat expresia PorA prin imunoblotting colonial folosind anticorpul monoclonal murin anti-P1.7 (MAB) MN14C11.6 (obținut de la NIBSC, Marea Britanie). În calitate de martor, reactivitatea a fost comparată între tulpina parentală X9 și tulpina mutantă PorA x9 xspora. Acest lucru a arătat că expresia PorA a fost neschimbată între godeurile de control și după expunerea la oricare dintre antimicrobienele testate (vezi Fig. 1B); astfel, scăderea susceptibilității de a atinge valoarea de la 9 la 9 xiftporb nu se datorează alterării valorilor expresiei PorA.
rezultatele noastre sunt în concordanță cu rapoartele anterioare pentru un rol pentru N. meningitidis PorB în cefalosporine și rezistența la tetraciclină (9, 11, 15). Paralelele cu porb1b gonococic în ceea ce privește rezistența la antibiotice sunt izbitoare. Eliminarea expresiei PorB a scăzut, de asemenea, susceptibilitatea meningococică la doxiciclină, una dintre terapiile recomandate pentru N. gonorrhoeae rezistente la multiplicare. În mod îngrijorător, acest lucru sugerează că presiunea selectivă poate duce la apariția variantelor de porb gonococice cu sensibilitate redusă la doxiciclină. Deși am înregistrat doar diferențe de 2 ori care sunt puțin probabil ca în mod izolat să conducă la eșecuri de tratament, sinergia variației PorB cu alte mutații are potențialul de a extinde spectrul de rezistență meningococică și gonococică. Nu am găsit nici o dovadă a unui rol pentru PorA în tranzitul antimicrobian prin membrana exterioară.