rezultate

am studiat șoarecii de tip sălbatic (WT), heterozigoți v2rv31r/WT și homozigoți v2r31r/V2R31R. Șoarecii mutanți au avut numere și frecvențe normale de celule T splenice mature și timocite la fiecare etapă de dezvoltare. Din cauza lipsei markerilor congenici, proteinele TCR-uri nu pot fi identificate prin alela care le codifică și nici dacă includ regiunile c-uri1 versus c-uri2. Astfel, am efectuat citometria în flux folosind anticorpi anti-V2 și anti-V31 pentru a cuantifica celulele care exprimă proteinele V2+ și V31+ TCR. Am testat timocitele CD4+ și CD8+ single-pozitive (SP) deoarece sunt celule T mature și naive. Reflectând datele publicate (8, 9), am detectat o mică fracțiune (0,11%) de celule care au colorat cu ambii anticorpi la șoarecii WT (Fig. 1 B și C), care este în concordanță cu o populație mică de V2+V31+ celule T de la 7 la sută. Am observat o fracție crescută de 12,4 ori a acestor celule la șoarecii V2R31R/WT și o creștere de 32,8 ori la șoarecii v2r31r/V2R31R (Fig. 1 B și C). Aceste frecvențe crescute ale celulelor Dual-TCR VIII + au corespuns cu utilizările mai mari ale v2 și V31 în lanțurile exprimate TCR VIII (Fig. 1 D-F). Aceste date demonstrează că îmbunătățirea calității RSS a două V-uri pe aceeași alelă crește rearanjarea acestora și, în consecință, fracțiunea de celule T care exprimă două tipuri distincte de proteine TCR-uri. Având în vedere că repertoriul de timocite SP de la V Inktv reflectă nivelurile relative pe care segmentele individuale de V Inktv le recombină (10), utilizarea preferențială a V31 față de V2 relevă faptul că V31R depășește V2R pentru rearanjare. Acest lucru s–ar putea datora unei accesibilități mai mari a V31 (11) sau interacțiunii V31 cu segmentele D–X-X-X-X-X înainte ca contracția locusului TCR X-X să plaseze V2 în apropierea segmentelor D-x-x-x-x-x. În special, creșterea mai mare de două ori a acestor celule duale-TCR XV+ la șoarecii v2r31r/V2R31R comparativ cu șoarecii V2R31R/WT implică faptul că două rearanjări distincte V(D)J XV pot contribui la expresia TCR XV din aceeași alelă.

Pentru a determina dacă un singur TCRß alelă poate într-adevăr să sprijine expresie a TCRß proteine din două diferite V(D)Jß rearanjamente, am analizat șoareci în cazul în care unul TCRß alelă este inactivat prin eliminarea TCRß enhancer (Eß) (12, 13). Am testat șoarecii care poartă alela e ștearsă de la e la e, opusă unei alele WT, o alelă cu o înlocuire RSS fie a V2 (V2R), fie a V31 (V31R), fie a ambelor (8). Am detectat un procent mic (0,094%) de timocite V2+ V31 + SP la șoarecii WT/e inkt (fig. 2 A și B), reprezentând potențial o populație rară de celule care exprimă două proteine TCR diferite din aceeași alelă WT. Indiferent, s-au observat celule V2+V31+ la o frecvență de 1,9 ori mai mare la șoarecii V2R/e Inktiv și la o frecvență de 4,8 ori mai mare la șoarecii V31r/e Inktiv (fig. 2 A și B). Astfel, îmbunătățirea calității fiecăreia dintre V-urile RSS crește fracțiunea de celule care exprimă atât proteinele V2+, cât și V31 + TCR. În mod notabil, am detectat o frecvență crescută de 14,4 ori a celulelor V2+V31+ la șoarecii V2rv31r/e la șoarecii V2rv31r/e la șoarecii VT / e la șoarecii VT / e (fig. 2 A și B), indicând faptul că îmbunătățirea calității a două Rsss V-uri v-uri crește sinergic procentul de celule care exprimă atât proteinele V2+, cât și V31+ TCR-uri. Într-adevăr, ștergerea unei părți a RSS V31 de pe alela V2R (alela V2R31 INKT; Fig. 2C) reduce dramatic frecvența celulelor V2 + V31 + la niveluri echivalente sau mai mici decât cele ale șoarecilor V2R/e (0,178% față de 0,135%; fig. 2 A și B). În mod colectiv, aceste date confirmă faptul că alela V2R31R promovează exprimarea a două proteine TCR distincte de la două rearanjări V(D)J Xqua diferite pe o singură alelă.

studiul nostru demonstrează că un mecanism genetic intrinsec guvernează asamblarea și expresia monogenică a TCR. Demonstrăm că rsss de calitate slabă v-XCT cooperează pentru a limita asamblarea și exprimarea a două gene TCR Xtct distincte dintr-o alelă. Am arătat anterior că v Rsss de calitate slabă restrânge stocastic V Frecvența de recombinare a VCT înainte de inhibarea feedback-ului pentru a reduce asamblarea bialelică și exprimarea genelor TCR (8). În continuare, concluzionăm că RSSs de calitate scăzută a V-XCT reduce, de asemenea, incidența pe care atât V31, cât și un v-XCT în amonte o recombină pe aceeași alelă. Aceste rearanjamente ar putea implica fie 1) un deletional V2 rearanjare a Dß1–Jß1–Cß1 cluster și un inversional V31 rearanjare a Dß2–Jß2–Cß2 cluster, sau 2) o inversional V31 rearanjare a Dß1–Jß1–Cß1 cluster, care inversează o parte din locus care conține Dß2–Jß2–Cß2 cluster, și apoi o inversional V2 rearanjare a Dß2–Jß2–Cß2 de bord (7) (Fig. 2D). Pentru a realiza monogenic TCR asamblare și exprimare, acest mecanism genetic bazat pe RSS ar putea funcționa cu procese epigenetice care au fost implicate pentru a impune recombinarea monoallelică V XV. De exemplu, s-a propus că interacțiunile dinamice de Vß segmente cu lamina nucleară scade Vß recombinare eficiența prin reprimarea Vß cromatinei accesibilitate și cromozomul looping între Dß–Jß clustere și în amonte Vß segmente (14, 15). În acest context, de proasta calitate Vß RSSs-ar putea reduce probabilitatea ca două Vß rearanjamente apar pe o alelă când V31 și o amonte Vß segment sunt atât de accesibile și amonte Vß este curbat în apropierea cu Dß–Jß segmente. Astfel, proprietățile RSSs pot sta la baza asamblării și exprimării monogene a proteinelor tcry de mamifere, TCR-uri și Ig-uri la mamifere și a proteinelor Ig-uri la peștii cartilaginoși. În plus, V RSSs poate contribui în mod similar la excluderea izotipică a Igk și Ig-ului în celulele B.