activarea RNase H

RNase H este o enzimă omniprezentă care degradează Catena ARN a unui duplex ARN–ADN. A fost identificat în organisme la fel de diverse precum virușii și celulele umane (Crouch și Dirksen, 1985). Cel puțin două clase de Rnază H au fost identificate în celulele eucariote. La procariote au fost observate enzime Multiple cu activitate de Rnază H (Crouch și Dirksen, 1985). Deși Rnaza H este implicată în replicarea ADN-ului, poate juca alte roluri în celulă și se găsește în citoplasmă, precum și în nucleu (Crum și colab., 1988). Cu toate acestea, concentrația enzimei în nucleu este considerată a fi mai mare și o parte din enzima găsită în preparatele citoplasmatice se poate datora scurgerilor nucleare.

elementele precise de recunoaștere pentru Rnaza H nu sunt cunoscute. Cu toate acestea, sa demonstrat că oligonucleotidele cu proprietăți asemănătoare ADN-ului, la fel de scurte ca tetramerii, pot activa Rnaza H (Donis-Keller, 1979). Modificările zahărului influențează activarea Rnazei H ca modificări ale zahărului care au ca rezultat oligonucleotide asemănătoare ARN-ului, de exemplu 2′-fluoro sau 2′-metoxi nu par să servească drept substraturi pentru Rnaza H (Sproat și colab., 1989; Kawasaki și colab., 1993). Modificările orientării zahărului către bază pot afecta, de asemenea, activarea Rnazei H, deoarece oligonucleotidele de la XV nu sunt capabile să inducă Rnaza H sau pot necesita recoacere paralelă (Gagnor și colab., 1989; Morvan și colab., 1991). În plus, modificările coloanei vertebrale influențează capacitatea oligonucleotidelor de a activa Rnaza H. Metilfosfonații nu activează Rnaza H (Maher și colab., 1989; Miller, 1989). În schimb, fosforotioații sunt substraturi excelente (Cazenave și colab., 1989; Mirabelli și colab., 1991; Stein și Cheng, 1993). În plus, moleculele himerice au fost studiate ca oligonucleotide care se leagă de ARN și activează Rnaza H (Furdon și colab., 1989; Quartin și colab., 1989). De exemplu, oligonucleotidele formate din aripi de 2′-metoxi fosfonați și un decalaj de cinci baze de dezoxioligonucleotide se leagă de ARN-ul lor țintă și activează Rnaza H (Furdon și colab., 1989; Quartin și colab., 1989). Mai mult, o singură ribonucleotidă într-o secvență de dezoxiribonucleotide s-a dovedit a fi suficientă pentru a servi drept substrat pentru Rnaza H atunci când este legată de deoxi-oligonucleotida sa complementară (Eder și Walder, 1991).

că este posibil să se profite de oligonucleotidele himerice concepute pentru a activa Rnaza H și au o afinitate mai mare pentru receptorii lor ARN și pentru a spori specificitatea a fost, de asemenea, demonstrată (Giles și Tidd, 1992; Monia și colab., 1993). Într-un studiu, scindarea mediată de Rnaza H a transcrierii țintă a fost mult mai selectivă atunci când dezoxioligonucleotidele compuse din aripi de metilfosfonat deoxioligonucleotidice și golurile fosfodiesterice au fost comparate cu oligonucleotidele fosfodiesterice complete (Giles și Tidd, 1992).

În ciuda informațiilor despre Rnaza H și demonstrația că multe oligonucleotide pot activa Rnaza H în testele enzimatice lizate și purificate, se știe încă relativ puțin despre rolul caracteristicilor structurale în țintele ARN în activarea Rnazei H (Minshull și Hunt, 1986; Gagnor și colab., 1987; Walder și Walder, 1988). De fapt, dovada directă că activarea Rnazei H este, de fapt, mecanismul de acțiune al oligonucleotidelor în celule a lipsit, până de curând.

studiile recente din laboratoarele noastre oferă informații suplimentare, deși indirecte, asupra acestor întrebări. ISIS 1939 este un fosforotioat de 20 mer complementar unei secvențe din regiunea 3 ‘ – netradusă a ARN ICAM-1 (Chiang și colab., 1991). Inhibă producția de ICAM în celulele endoteliale ale venei ombilicale umane, iar bloturile nordice demonstrează că ARNm ICAM-1 este degradat rapid. Un analog 2 ‘ – metoxi al ISIS 1939 prezintă o afinitate mai mare pentru ARN decât fosforotioatul, este stabil în celule, dar inhibă producția de proteine ICAM-1 mult mai puțin puternic decât ISIS 1939. Este probabil ca ISIS 1939 să destabilizeze ARN-ul și să activeze Rnaza H. În schimb, ISIS 1570, un fosforotioat de 18 mer care este complementar codonului de inițiere a traducerii mesajului ICAM-1 a inhibat producția proteinei, dar nu a provocat degradarea ARN-ului. Astfel, două oligonucleotide care sunt capabile să activeze Rnaza H au avut efecte diferite în funcție de locul din ARNm la care s-au legat (Chiang și colab., 1991). O demonstrație mai directă că Rnaza H este probabil un factor cheie în activitatea multor oligonucleotide antisens a fost furnizată de studii în care PCR de ligare inversă a fost utilizat pentru a identifica produsele de clivaj din ARNm bcrab în celulele tratate cu oligonucleotide fosforotioate (Crooke și colab., 1995).

având în vedere rolul emergent al oligonucleotidelor himerice cu modificări în aripile 3′ și 5’concepute pentru a spori afinitatea pentru stabilitatea ARN – ului țintă și nucleazei și un decalaj de tip ADN pentru a servi drept substrat pentru Rnaza H, studiile axate pe înțelegerea efectelor diferitelor modificări asupra eficienței enzimei(enzimelor) sunt, de asemenea, de o importanță considerabilă. Într-un astfel de studiu privind E. coli RNase H, am raportat că enzima prezintă o specificitate minimă a secvenței și este procesivă. Când o oligonucleotidă himerică cu zaharuri modificate 2’în aripi a fost hibridizată la ARN, locul inițial de scindare a fost nucleotida adiacentă joncțiunii metoxi-deoxi cea mai apropiată de capătul 3′ al substratului ARN. Rata inițială de clivaj a crescut pe măsură ce dimensiunea decalajului ADN a crescut și eficiența enzimei a fost considerabil mai mică față de o țintă ARN duplexată cu o oligonucleotidă antisens himerică decât o oligonucleotidă completă de tip ADN (Crooke și colab., 1995).

în studiile ulterioare, am evaluat interacțiunile oligonucleotidelor antisens cu ținte structurate și nestructurate și impactul acestor interacțiuni asupra Rnazei H mai detaliat (Lima și Crooke, 1997). Folosind o serie de substraturi non-clivabile și analize Michaelis-Menten, am putut evalua atât legarea, cât și clivajul. Am arătat că, de fapt, E. coli Rnaza H1 este o proteină de legare a ARN-ului cu două catene. Kd pentru duplexul ARN a fost de 1,6 mm; Kd pentru un duplex ADN a fost de 176 mm; iar Kd pentru ADN-ul monocatenar a fost de 942 mm. În schimb, enzima ar putea scinda ARN doar într-un duplex ARN-ADN. Orice 2 ‘- modificare a medicamentului antisens la locul de clivaj a inhibat clivajul, dar reducerea semnificativă a sarcinii și 2′-modificări au fost tolerate la locul de legare. În cele din urmă, plasarea unei sarcini pozitive (de exemplu, 2’-propoxiamină) în medicamentul antisens a redus afinitatea și scindarea. De asemenea, am examinat efectele structurilor ARN induse de oligonucleotide antisens asupra activității E. coli RNase H1 (Lima și Crooke, 1997). S-a constatat că orice structură din substratul duplex are un efect negativ semnificativ asupra ratei de scindare. Mai mult, scindarea siturilor selectate a fost inhibată în întregime, iar acest lucru a fost explicat prin obstacolul steric impus de bucla ARN care traversează canelurile minore sau majore sau heteroduplexul. Recent am clonat și exprimat Rnaza umană H1. Proteina este omologă cu E. coli Rnaza H1, dar are proprietăți similare cu cele descrise pentru Rnaza h umană de tip 2 (Frank și colab., 1994; Wu și colab., 1998). Enzima este stimulată de concentrații scăzute de Mg2+, inhibată de concentrații mai mari și este inhibată de Mn2+ în prezența Mg2+. Este de 33 kDa în greutate moleculară. Este proteină de legare a ARN-ului cu două catene și prezintă preferințe unice de poziție și secvență pentru clivaj (Wu și colab., 1999). În plus, rnaza umană H2 A fost clonată, dar până în prezent proteina exprimată nu s-a dovedit a fi activă (Frank și colab., 1998). Foarte recent, am raportat efectele mai multor mutații introduse în Rnaza umană H1 asupra activității enzimei (Wu și colab., 2000). Astfel, avem acum instrumentele necesare pentru a începe să explorăm rolurile Rnazei H umane în procesele biologice și farmacologice și să începem să dezvoltăm medicamente concepute pentru a interacționa cu ele mai eficient.

în cele din urmă, cel puțin în ceea ce privește degradarea indusă de Rnaza H a ARN-ului vizat, am demonstrat recent că în intervalul de 1-150 de copii de ARN pe celulă, nivelul ARN-ului țintă nu are niciun efect asupra potenței inhibitorilor antisens (Miraglia, 2000). Acest lucru se datorează faptului că numărul de molecule de medicament antisens pe celulă depășește numărul de copii ale ARN cu mai multe ordine de mărime. Astfel, alți factori trebuie să fie rata de limitare.