o metodă extrem de eficientă de transfer de gene în celula mamiferelor este prin infecția cu vectori retrovirali. Eficiența infecției retrovirale este îmbunătățită semnificativ, de 100 până la 1000 de ori în unele celule, prin includerea polibrenului în timpul infecției. Polibrenul cu șoc DMSO este, de asemenea, utilizat pentru a media transferul ADN într-o varietate de tipuri de celule, cum ar fi cho, fibroblaste embrionare de pui, NINH-3T3 și celule mieloide.
Protocolul: Infecția retrovirală
stocurile retrovirale recombinante sunt preparate prin adăugarea a 5 ml de mediu de creștere cu 5% ser la un monostrat aproape confluent de celule de ambalare retrovirale transfectate într-o placă de 100 mm. După 24 de ore, mediul este îndepărtat și filtrat printr-un filtru de 0,45 um. celulele care urmează să fie infectate cu acest stoc retroviral recombinant sunt placate la 500.000 de celule pe placă de 100 mm în 10 ml de mediu complet. 24 de ore mai târziu, îndepărtați mediul de creștere din celule. Infectează celulele cu 2 ml de supernatant viral (sau o diluție a stocului de virus în 2 ml) în prezența a 5ug până la 10 g de polibren per ml (concentrație finală). Se incubează celulele timp de 3 până la 6 ore la 37 C.
se adaugă 8 ml de mediu complet. La trei zile după infecție, împărțiți celulele 1:5 în mediu de selecție. Toyoshima, K. și Vogt, P. K., 1969. Virologie. 38: 414-426
Coelen, J. R., Jose, D. G. și mai, J. T. 1983. Arch. Virol. 75: 307-311
Protocol: transfecție
celule Plate la aproximativ 50% confluență în mediu complet de creștere.
18-24 de ore după placare, pregătiți soluția ADN-Mediu-Polibren, imediat înainte de a utiliza după cum urmează:
notă: Fiecare componentă trebuie adăugată în ordinea corectă.
1: mediu de creștere complet (2mls pentru o placă de 60 mm și 3mls pentru o placă de 100 mm) încălzit la 37 C. C.
2: ADN plasmidic, 10ng la 10ug. Se amestecă ușor.
3: Polibren la o concentrație finală de 5UG la 10ug per ml. Se amestecă ușor
îndepărtați mediul de pe placă și adăugați soluția ADN-Mediu-Polibren la celule. Se incubează celulele la 37 centimetric C timp de 6 până la 20 de ore, cu balansare ușoară ocazională aproximativ la fiecare 1.5 ore pentru primele 6 ore.
îndepărtați soluția ADN-Mediu-Polibren și suprapuneți ușor celulele cu soluție de șoc DMSO (15% DMSO în 1x HBSS: catalog media de specialitate #s-051-D) 3mls pe vas de 60 mm și 4mls pe placă de 100 mm. Rock manual vasul timp de 10 secunde pentru a distribui uniform soluția, și apoi se incubează celulele pentru exact 4 minute la 37 centimetric C.
imediat scoateți soluția de șoc DMSO și clătiți ușor celulele de două ori cu mediu de creștere completă, 5mls pe spălare pe 60mm antena, 10mls pe spălare pe 100mm antena
Adauga mediu de creștere completă a celulelor.
pentru transformanții stabili, îndepărtați mediul de creștere și împărțiți celulele 1:5 în mediu de selecție.
pentru exprimarea tranzitorie, îndepărtați mediul de creștere și adăugați mediu de creștere proaspăt. Recoltați celule și / sau mediu după 24 până la 72 de ore. Chaney, W. G. și colab., 1986. Celule somatice și Genetică Moleculară. Vol. 12, nr 23,
237-244.
Aubin, R. J. și colab. 1988. Celule somatice și Genetică Moleculară. Vol. 14, Nr. 2, 155-167.
Chisholm, O. și colab., 1998. Cercetarea Acizilor Nucleici. Vol. 16, No.5, 2352
reactivul este furnizat filtrat prin membrane 0.2 um și hidratat cu H20 steril.