Lott werd geselecteerd in de eerste ronde (8e algemeen) van de 1981 NFL Draft door de San Francisco 49ers. Het niveau van vaardigheid aangetoond door de 6-voet, 203-Pond standout werd onmiddellijk herkend, en vanaf het allereerste begin van het trainingskamp had hij de baan als de 49ers’ starting left cornerback. In zijn rookie seizoen in 1981, hij opgenomen zeven intercepties, hielp de 49ers om Super Bowl XVI te winnen, en werd ook slechts de tweede rookie in de NFL geschiedenis om drie intercepties terug te keren voor touchdowns. Zijn uitstekende spel resulteerde in zijn tweede finish voor rookie of the year honors, achter New York Giants linebacker Lawrence Taylor.

Lott schakelde in 1985 over op de veiligheidspositie. Hij had het puntje van zijn linker pink vinger geamputeerd na het seizoen 1985 toen het werd verpletterd terwijl het aanpakken van running back Timmy Newsome, en een bottransplantatie zou hem niet hebben toegestaan om het seizoen 1986 te beginnen. Een blessure buitenspel gezet hem voor de laatste twee wedstrijden van het seizoen in 1986, maar hij nog steeds leidde de competitie met een carrière-beste 10 intercepties, terwijl het opnemen van 77 tackles, drie gedwongen fumbles, en twee quarterback sacks. In zijn 10 jaar bij de 49ers, Lott hielp hen winnen acht divisie titels en vier Super Bowls: XVI (1981 seizoen), XIX (1984), XXIII (1988), en XXIV (1989). Hij is een van de vijf spelers die waren op alle vier de jaren 1980 49ers Super Bowl wint. De andere vier zijn quarterback Joe Montana, linebacker Keena Turner, cornerback Eric Wright en wide receiver Mike Wilson.na zijn carrière bij San Francisco tekende Lott in 1991 bij de Los Angeles Raiders en in 1993 bij de New York Jets. In 1991 leidde hij de league in interceptions (8) voor een tweede keer. Lott tekende een deal met de Kansas City Chiefs in 1995, maar raakte gewond in het voorseizoen. Hij keerde terug naar de 49ers in 1995, maar de verwondingen die hij had opgelopen in de voorgaande vier seizoenen bleef hem teisteren, en hij kondigde zijn pensioen voordat het seizoen begon. Hij werd verkozen tot de Pro Football Hall of Fame in 2000, zijn eerste jaar van geschiktheid, en werd ook genoemd naar de NFL ‘ s 75th Anniversary Team in 1994 en de 100th Anniversary Team in 2019.in zijn 14 NFL-seizoenen nam Lott 8,5 sacks en 63 intercepties op, die hij terugkeerde voor 730 yards en vijf touchdowns. Hij herstelde 17 fumbles, gaf ze terug voor 43 yards, en behaalde 113 yards op kickoff returns. Lott speelde ook in 20 postseason games, het opnemen van negen intercepties, 89 tackles, een geforceerde fumble, een fumble recovery, en twee touchdowns. Daarnaast werd hij acht keer All-Pro genoemd, zes keer ALL-NFC en één keer ALL-AFC. Buiten de statistieken, Lott had een griezelig bewustzijn van hoe een spel zich ontwikkelt, die hem in staat stelde om te breken passes en verdienen een reputatie als een van de moeilijkste en meest efficiënte open-field tacklers in de geschiedenis van de league.