extracellulär matrisberedning och reologi

ECM består av ett nätverk av gelatin och fibrin. För att förbereda ECM-komponenterna produceras en 15 wt/v% gelatinlösning (Typ A, 300 Blom från svinhud, Sigma) först genom att tillsätta gelatinpulver till en varm lösning (70 CCB) DPBS (1x dulbelcos fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium). Gelatinet får fullständigt lösas upp genom omröring i 12 h vid 70 kcal C, och pH justeras sedan till 7,5 med användning av 1 M NaOH. Lösningen är steril filtreras och lagras vid 4 C i alikvoter för senare användning i gjutning (<3 månader). En fibrinogenlösning (50 mg/mL) framställs genom upplösning av lyofiliserat bovint blodplasmaprotein (Millipore) vid 37 kcal C i sterila DPBS utan kalcium och magnesium. Lösningen hålls vid 37 CCG utan omröring i minst 45 min för att möjliggöra fullständig upplösning. Transglutaminas (TG) – lösningen (60 mg/mL) bereds genom att lösa upp lyofiliserat pulver (Moo Gloo) i dpbs utan kalcium och magnesium och blandas försiktigt i 20 sek. lösningen hålls sedan vid 37 kcal C i 20 min och steril filtreras före användning. En CaCl2 stamlösning (250 mM) framställs genom upplösning av CaCl2-pulver i DPBS utan kalcium och magnesium (Corning). För beredning av stamlösning av trombin, lyofiliserat trombin (Sigma Aldrich) rekonstitueras vid 500 U/mL med användning av sterila DPBS och lagras vid -20 kcal C. trombin alikvoter tinas omedelbart före användning.

en kontrollerad spänningsreometer (DHR-3, Ta-instrument, New Castle, DE) med en diameter på 40 mm, 2 msk kon och plattgeometri används för mätningar av bläckreologi. Skjuvlagringsmodulerna (G’) och förlustmodulerna (G”) mäts vid en frekvens av 1 Hz och en oscillerande stam (0,01, 0,0. Tidssvepningar utförs genom att snabbt placera en förblandad ECM-lösning som innehåller trombin på Peltier-plattan som hålls vid 37 C.

Bläckformuleringar

två bläck krävs för 3D-bioprinting av perfuserbara PT-modeller. Ett bläck, som används för att skapa perfusionschippackningen, består av en tvådelad silikonelastomer (SE 1700, DOW Chemical) med en 10:1 bas till katalysator (i vikt) som homogeniseras med hjälp av en centrifugalblandare för 2 min (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Japan). Silikonbläcket skrivs ut inom 2 h efter blandning med katalysator. Detta bläck laddas i en spruta (EFD Inc., East Providence, RI) och centrifugeras för att avlägsna eventuella luftbubblor före utskrift vid rumstemperatur. Det andra bläcket, ett flyktigt bläck som används för att skriva ut tubulen, består av 38 wt% Pluronic F127 (Sigma) och 100 U/mL trombin i avjoniserat, ultrafiltrerat (DIUF) vatten. Det flyktiga bläcket färgas Rosa genom tillsats av ett Riskreaktorfärgämne för visualisering i Fig. 1 och film S1. För att framställa detta bläck homogeniseras en 40 wt% Pluronic F127-lösning i vatten med användning av en Tunnblandare tills pulvret är fullständigt upplöst och lagras därefter vid 4 kg C. Före användning tillsätts en 2000 U/mL trombinlösning till det flyktiga (Pluroniska) bläcket i ett förhållande av 1:20 och homogeniseras med användning av en Tunnblandare. Det flyktiga bläcket laddas sedan i en spruta (EFD Inc., East Providence, RI) vid 4 msk C och centrifugeras för att avlägsna eventuella luftbubblor. Före utskrift jämviktas detta bläck vid rumstemperatur i minst 15 minuter.

Bioprinting av perfusable 3D proximal tubule constructs

3D PT constructs tillverkas med hjälp av en specialdesignad, multimaterial 3D bioprinter utrustad med fyra oberoende adresserbara skrivhuvuden monterade på en 3-axlig, rörelsestyrd portal med en byggvolym på 725 mm 650 mm 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Bläck är inrymda i separata sprutfat till vilka munstycken av varierande storlek (dvs. 50 oc–410 oc-m diameter) är fästa via ett luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Bläck extruderas genom deponeringsmunstycken genom att applicera lufttryck (800 Ultra dispenseringssystem, EFD Inc., East Providence, RI, USA), som sträcker sig från 10-90 psi, motsvarande utskriftshastigheter mellan 1 mm/s och 5 cm/s. vi skriver först ut den anpassade perfusionschippackningen genom att deponera silikonbläcket genom ett avsmalnande 410 oc-munstycke på 50 mm 75 mm glasskivor. Packningsdesignen skapas med hjälp av ett anpassat Matlab-skript som genererar G-kod för en slutlig packningsstruktur. Efter utskrift härdas perfusionschipspackningen vid 80 C i en ugn för >1 h och förvaras vid rumstemperatur före användning.

mönstring 3D PTs inom perfusionschipet kräver en kombination av gjutning av ECM och utskrift av det flyktiga bläcket. Först skapas ECM-lösningen genom att kombinera 10 mg/mL fibrinogen, 7,5 wt% gelatin, 2,5 mM CaCl2 och 0,2 wt% TG. Denna lösning jämvikts sedan vid 37 C i 15-20 min före användning för att förbättra optisk klarhet i ECM25. Därefter blandas lösningen snabbt med trombin i ett förhållande av 500:1, vilket resulterar i en slutlig trombinkoncentration av 1 U/mL. Inom 2 minuter vid 37 c c följer polymerisation av fibrinogen till fibringel. Av denna anledning måste ECM-lösningen gjutas på basen av perfusionschipet omedelbart efter blandning med trombin. Bas ECM-skiktet får sedan torka något under kväve, så att det bildar en plan yta. Det flyktiga Pluroniska f127-bläcket (med 100 U/mL trombin) skrivs ut på bas ECM-skiktet i form av en invecklad filmament (tubule) med användning av ett avsmalnande 200 micrm-munstycke. Ett anpassat Python-skript (MeCode) används för att ange verktygsbanan i G-kod. Direkt efter Flyktig bläckutskrift, metall ihåliga perfusionsstift gränssnitt genom silikonpackningen bringas i kontakt med det tryckta bläcket. Ett toppskikt av ECM bildas sedan genom att gjuta ECM-lösningen över den tryckta tubulen, som beskrivits ovan, till inom 1-2 mm från packningsväggarnas höjd. Om celler, såsom HNDFs, införlivas i ECM (Fig. S5) blandas de in direkt efter jämviktsperioden, före trombinblandning och efterföljande gjutning. Efter det övre ECM-skiktet är gjutet, konstruktionen är täckt med en glasskiva för att förhindra avdunstning eller kontaminering och hålls vid 37 C i 1 h för att tillåta fibrinpolymerisation att avsluta och TG för att tvärbinda nätverket. Konstruktionen kyls sedan till 4 C i 15-20 min för att kondensera det tryckta flyktiga bläcket, som spolas ut ur enheten med kallcellsmedia och lämnar bakom öppna ledningar som fungerar som det önskade rörformiga nätverket inbäddat i ECM med eller utan celler i det extratubulära ECM-utrymmet.

med den här metoden producerade vi också 3D-arkitekturer i en lager-för-lager-byggnadssekvens. Till exempel, varje enskilt skikt av den treskiktsstruktur som visas i Fig. S10 har konstruerats med hjälp av ett modifierat tryckprotokoll som innehåller material och metoder som tidigare diskuterats. Efter utskrift av de första tubuli med flyktigt bläck, ett skikt av ECM gjuts över trycket och tillåts 20 min till gel vid 37 kub C innan nästa proximala tubuli skiktet trycks med flyktigt bläck ovanpå den nyligen gelade skiktet. Denna successiva konstruktion introducerar 3D-geometri och möjliggör framgångsrik evakuering av alla kanaler oberoende efter konstruktion. Vattenbaserade riskreaktorfärger perfuseras genom kanalerna och exciteras med UV-ljus för visualisering.

för att slutföra 3D-vävnadschipmonteringsprocessen placeras varje PT-konstruktion på en bearbetad rostfri bas och ett tjockt akryllock placeras ovanpå. Locket och basen kläms ihop med fyra skruvar och bildar en tätning runt den tryckta silikonpackningen. Därefter fylls sterilt peristaltiskt rör med två stopp (PharMed BPT, 0,25 mm inre diameter) med media och ansluts till utloppet på ett sterilt filter som är fäst vid en 10 ml sprutfat (EFD Nordson), som fungerar som en mediereservoar. Ptec media (designad för tillväxt, så ATCC-formulering plus 1% FBS, 1% aprotinin och 1% anti-anti) som har jämvikts för >3 h i en inkubator vid 37 C, 5% CO2 läggs till mediebehållaren och slangen från behållaren är ansluten till chipets utlopp (metall ihålig perfusionsstift). En spruta används sedan för att utöva lätt tryck på mediet i tunnan, vilket tvingar det att komma in och helt fylla den bifogade slangen. Fyllning av slangen med media innan den ansluts till kretsen förhindrar införande av luftbubblor i systemet. För att slutföra perfusionskretsen är silikonrör från behållaren ansluten till inloppsmetallperfusionsstiftet på chipet. Slangklämmor läggs till vid inloppet och utloppet på perfusionschipet för att förhindra okontrollerat flöde när det kopplas bort från den peristaltiska pumpen, vilket kan skada epitelet eller tillåta luftbubblor att komma in i systemet. Mediebehållaren jämvikts med atmosfäriska förhållanden i inkubatorn hela tiden med hjälp av ett sterilt filter ovanpå mediebehållaren.

cellkultur

Human immortalized PTECs (Rptec / TERT1, ATCC CRL-4031) odlas enligt ATCC: s instruktioner och används för alla PT-modellstudier upp till passage 20. För genuttrycksanalys används och odlas humana primära rptec (Cellvetenskap), odödliga ptecs (RPTEC-TERT1, Evercyte) och a498 (ATCC HTB-44) njurcancerceller enligt leverantörens instruktioner. Mänskliga neonatala dermala fibroblaster (HNDF), GFP-uttryck (Angio-Proteomie) odlas enligt leverantörens instruktioner och används upp till passage 15.

genuttrycksanalys

Human primary rptec (Cell Science), immortalized rptec-TERT1 (Evercyte) och a498 (ATCC HTB-44) njurcancerceller odlas i 96-brunnsplattor enligt leverantörens instruktioner och samlas in vid Dag 3 efter sammanflödet genom att ersätta odlingsmedium med 100 Bac/brunn av 1x RNA-lysblandning (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101). Sedan blandas 40 oC lysat med en mRNA-infångningsmagnetisk pärlsats (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, katalognummer 312631), inkuberas över natten, bearbetas för Grenad DNA-amplifiering och analyseras enligt tillverkarens instruktioner (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). Ppib-sonden används som en hushållningsgen för normalisering. Fluorescensintensitet (Fi) data presenteras som medel-och standardavvikelse för 3 biologiska replikat.

Cytokinanalys av mediaperfusat

Mediaperfusat samlas in från en tubule under en period av 25 dagar efter cellsådd och lagras vid -80 kcal C före analys. För cytokinprofilering tinas supernatanter på is, späds 2x i provutspädningsbuffert (BioRad-katalog #M60-009RDPD) och analyseras med Luminex-teknikbaserad ELISA med hjälp av Bio-Plex Pro-humant Kemokin IL-6 (Set #171bk29mr2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) och MCP-1 (Set #171-BK36MR2) och Bio-Plex 200-systemen (biorad) enligt tillverkarens anvisningar. Data rapporteras som genomsnittliga cytokinkoncentrationer och standardavvikelser för tekniska triplikat.

epitelisering och longitudinell kultur

varje 3D PT-konstruktion perfuseras i flera timmar med PTEC-media i inkubatorn före cellbelastning/sådd. PTECs (PTEC/TERT1, ATCC) trypsiniseras från sin odlingsskål och koncentreras i media till ~2 107 celler/ml av 107. Cellsuspensionen laddas sedan in i perfusionschipet genom utloppet (Fig. S3b, c). Den belastade konstruktionen placeras i sidled i inkubatorn i flera timmar och vänds 180 kg under flera halvtimmesintervaller för att möjliggöra enhetlig sådd av tubulärväggarna och inkuberas sedan i tubulen utan flöde över natten. Nästa dag spolas icke-vidhäftande celler ut ur tubulen under flöde av tyngdkraften. Perfusion av färska medier startas sedan och de återstående cellerna börjar kluster och växer sedan från dessa kolonier (Fig. S3f) tills de når sammanflöde cirka 3 veckor efter sådd (Fig. S3k). Under tillväxtfasen matas Ptec-medier beredda enligt ATCC-riktlinjer plus 1% Aprotinin (EMD Millipore, som används för att bromsa nedbrytningen av ECM), 1% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotikum-antimykotiskt (Gibco). Efter mognad avlägsnas FBS och ptecs packas i ett tätt epitelmonolager (film S2). Vid Dag 1 efter sådd utsätts Ptec: erna för kontinuerligt, enkelriktat flöde vid 1 kg/min, vilket motsvarar skjuvspänningar som varierar mellan 0,1 och 0,5 dyn/cm2 beroende på tubuli tvärsnitt. Media matas via en peristaltisk pump i en sluten krets och byts var 2: e dag.

Albuminupptagningsstudie

Albuminupptag utvärderas för tryckta 3D PT-modeller samt 2D-kontroller. Den första kontrollen består av ptecs odlade på vävnadskulturplast, medan den andra kontrollen består av PTECs odlade på vår ECM. I varje fall odlas PTECs till sammanflöde och får mogna i serumfria medier. Humant serumalbumin konjugerat med FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) suspenderas i PTEC-media vid 50 kg/mL. Alla prover inkuberas med HSA-FITC i deras media i 2 h (i fallet med perfusion perfuseras den genom den öppna lumen). Efter exponering tvättas alla prover med 3x volym och trypsiniseras sedan med 10x trypsin för att samla de enskilda cellerna. Celler är fixerade och motfärgade med primära och sekundära antikroppar för megalin (tabell S2 listar de specifika antikropparna som används). Celler från dessa prover och nakna celler analyseras med flödescytometri (BD LSR Fortessa) och data samlas in från n = 10 000 celler per prov. För att få bilder av HSA-FITC och megalin i PTECs fixeras prover på plats med formalin istället för att försökas efter tvättsteget. Dessa tar prov är counterstained för megalin och avbildas genom att använda confocal microscopy (Zeiss LSM710).

cyklosporin A-testning

effekten av CysA på både 2D-kontroller och bioprintade 3D-PTs undersöks. I 2D såddas celler i ett 96-brunnsformat på vävnadskulturplast och odlas till sammanflöde. De matas media enligt ATCC: s riktlinjer. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) suspenderas i deras media vid olika koncentrationer och inkuberas med celler i 24 timmar. en viabilitetsanalys med användning av(3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboximetoxifenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2h-tetrazolium) i närvaro av fenazinmethosulfat (MTS) körs vid 24 h-märket efter exponering. Denna analys är klar på ptecs vid tidig sammanflöde, genom att ge CysA till cellerna den dag de nådde sammanflöde, liksom sen sammanflöde, genom att ge CysA flera dagar efter att de nått sammanflöde. I synnerhet är toxicitetsresultaten lika för varje fall (Fig. 5n). För 3D PTs matas CysA i olika koncentrationer genom den öppna lumen av mogna tubuler efter att ha nått sammanflöde (vid ~3 veckors märke), där inget serum ingår i media i minst 10 dagar. Vid 24 h-märket efter CysA-exponering utförs ett FITC-dextran-läckagetest (beskrivet nedan) för att bedöma och kvantifiera störningar till ptecs barriärfunktion. Direkt efter fixeras PT med 10% buffrad formalin i 1 h och motfärgas för aktin och DAPI (tabell S2 listar de specifika fläckar som används).

Diffusionspermeabilitetsmätningar

för att bedöma barriärfunktionen hos epitelet i 3D kvantifieras diffusionspermeabilitet genom att perfusera PTEC-media i det öppna lumen som innehåller 25 kg/mL FITC-konjugerad 70 kDa dextran (FITC-Dex, Sigma-produkt 46945) med en hastighet av 15 kg/min i 3 minuter och 1 kg/min därefter i ~30-45 minuter. Hela testet utförs under levande cellavbildning med både tubulen och den omgivande ECM i synfältet (Fig. S9). Diffusionsmönstret för FITC-Dex detekteras med hjälp av ett brett fält fluorescerande mikroskop (Zeiss Axiovert 40 CFL). Fluorescensbilder fångas före perfusion och var 3 till 5 min under en 30-45 min period. Diffusionspermeabilitet för FITC-Dex beräknas genom att kvantifiera förändringar i fluorescensintensitet över tiden med hjälp av följande ekvation34;

Pd är diffusionspermeabilitetskoefficienten, I1 är den genomsnittliga intensiteten vid en initial tidpunkt, I2 är en genomsnittlig intensitet vid t ~ 30-45 min, Ib är bakgrundsintensitet (bild tagen före perfusion av FITC-Dex), och D är kanalens diameter. Andra forskare har rapporterat att PTECs kan resorbera dextran39, vilket skulle leda till något högre värden för den uppmätta diffusionspermeabiliteten.

vi undersökte också barriäregenskaperna hos våra epitelfodrade tubuler med användning av en lågmolekylär förening, inulin (4,5 kDa) som varken resorberas eller utsöndras in vivo av PTECs med samma metod som beskrivits ovan. Specifikt löses inulin-FITC (Sigma-produkt F3272) i värmt PTEC-medium vid 100 oc/mL och perfuseras i det öppna lumen med en hastighet av 20 oC/min i 3 min och 1,5 oc/min därefter i ~15 min. Hela testet utförs under levande cellavbildning med både tubulen och den omgivande ECM i synfältet (Fig. S7). Diffusionsmönstret för FITC-inulin detekteras med hjälp av ett brett fält fluorescerande mikroskop (Leica). Fluorescensbilder fångas med en gated ljuskälla och rörelsestyrd scen före perfusion och varje 3 till 5 min under 15 min-perioden för att samla tekniska tredubbla mätningar.

elektronmikroskopi

för transmissionselektronmikroskopi (TEM), ptecs i 2D-eller 3D-arkitekturer eller frisk human njurvävnad erhållen från en standardbiopsi före transplantation fixeras med 2,5% glutaraldehyd, 1,25% paraformaldehyd och 0,03% pikrinsyra i 0,1 m natriumkakodylatbuffert (pH 7,4) i minst flera timmar. Små prover (1 mm 1 mm 1 mm) tas bort och tvättas i 0,1 m kakodylatbuffert och badas i 1% osmiumtetroxid (OsO4) (EMS) och 1.5% potassiumferrocyanid (KFeCN6) (Sigma) för 1 h, tvättas i vatten 3x och inkuberas i 1% vattenhaltig uranylacetat (EMS) för 1 h följt av 2 tvättar i vatten och efterföljande uttorkning i olika kvaliteter av alkohol (10 min vardera; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Proverna sätts sedan i propylenoxid (EMS) i 1 h och inkuberas över natten i en 1:1-blandning av propylenoxid och TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kanada). Följande dag proverna är inbäddade i TAAB Epon och polymeriseras vid 60 C i 48 timmar. Ultratunna sektioner (ca 60 nm) skärs på en Reichert Ultracut-s-mikrotom, placeras på kopparnät färgade med blycitrat och undersöks i ett JEOL 1200ex transmissionselektronmikroskop och bilder registreras med en AMT 2K CCD-kamera. Bildanalys utförs med hjälp av ImageJ programvara.

för scanningelektronmikroskopi (SEM) är perfuserade PTECs i 3D fixerade med 10% buffrad formalin för 1 h. proverna är tunt skivade (~1 mm tjocka) för att exponera celler som omger den öppna lumen. Fixativet tvättas bort med användning av PBSx2 och efterföljande uttorkning i varierande kvaliteter etanol (20 min vardera; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Proverna placeras sedan i 50% etanol och 50% hexametyldisilazan (HMD) för 30 min följt av 100% HMD 3 20 min. Alla steg utförs i en sluten och förseglad glasbehållare. Efter den slutliga tvätten med HMD avlägsnas proverna och placeras i en öppen behållare under N2 i rökhuven för att torka. Torkade prover monteras på aluminiumstiftfästen med ledande koltejp, sputter belagd med guld och avbildas med en Tescan Vega SEM.

immunfärgning

immunfärgning följt av konfokalmikroskopi används för att bedöma cellulär lokalisering av proteiner i 2D-och 3D-ptec-modeller. Före immunfärgning tvättas varje konstruktion med PBS och fixeras sedan i 20 min till 1 h med 10% buffrad formalin. Fixativet avlägsnas med flera tvättar i PBS i flera timmar och blockeras sedan över natten med 1 vikt% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Primära antikroppar mot cellproteinet eller biomarkören av intresse inkuberas med konstruktionerna i 1 dag vid utspädningarna som anges i tabell S2 i en lösning av 0,5 wt% BSA och 0,125 wt% Triton X-100. Avlägsnande av obundna primära antikroppar åstadkommes med användning av ett tvättsteg mot en lösning av PBS eller 0,5 wt% BSA och 0,125 wt% Triton X-100 i PBS under 1 dag. Sekundära antikroppar inkuberas med konstruktionerna i 1 dag vid utspädningarna som anges i tabell S2 i en lösning av 0,5 wt% BSA och 0,125 wt% Triton X-100 i PBS. Proverna motfärgas med NucBlue eller ActinGreen i 2 timmar och tvättas sedan i 1 dag i PBS före avbildning.

bildåtergivning och analys

fas kontrakt mikroskopi utförs med användning av en inverterad Leica DM IL omfattning med mål som sträcker sig från 1,25 x till 40X. konfokal mikroskopi utförs med användning av en upprätt Zeiss LSM 710 med vatten nedsänkning mål som sträcker sig från 5x till 40x anställa spektrala lasrar vid 405, 488, 514, 561, och 633 nm våglängder. Bildrekonstruktioner av Z-stackar utförs i ImageJ med z-projektionsfunktionen med inställningen för maximal pixelintensitet. Eventuella ökningar i ljusstyrka utförs enhetligt över en hel z-projicerad bild. 3D-bild rekonstruktioner och roterande Filmer (film S3) utförs med hjälp av Imaris programvara. Det nya CytoSMART (Lonza) i inkubatorsystemet används för att fånga time-lapse imaging (film S2). Bildanalys för kvantifiering av diffusional permeabilitet utförs med hjälp av anpassade MATLAB-skript som använder tidigare rapporterade metoder34. TEM – bildanalys utförs med hjälp av ImageJ-programvara för att mäta cellhöjd (n 20), mikrovilli-densitet (n 25) och mikrovilli-längd (n 150) över minst 3 oberoende prover för varje tillstånd.

statistisk analys

data uttrycks som medelvärde för standardavvikelse i enlighet med detta. Statistisk analys utförs med hjälp av MATLAB och statistisk signifikans bestäms till ett värde av p < 0,05 som bestäms av en ANOVA med hjälp av Tukeys multipla parvisa jämförelsetest. Olika signifikansnivåer (p-värden) anges med asterisker och specifika p-värden anges i varje figurförklaring.