reglering av hjärt Sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ upptag av Fosfolamban

i början av 1970-talet rapporterades en upptäckt av Arnold Katz (Tada et al1), som visade att fosforylering av isolerade hjärt sarkoplasmatiska retikulummembran inträffade huvudsakligen på ett protein med låg molekylvikt. Detta fosfoprotein fick namnet fosfolamban, från de grekiska rotord som betyder ” att ta emot fosfat.”1 Fosfolamban är ett litet protein, innefattande 52 aminosyrarester, och det är närvarande i hjärt -, släta och långsamma skelettmuskler. Emellertid har dess reglerande effekter huvudsakligen studerats i hjärtmuskeln. In vitro-studier indikerade att fosfolamban kan fosforyleras på tre distinkta ställen med olika proteinkinaser: serin 10, med proteinkinas C; serin 16, med cAMP – eller cGMP-beroende proteinkinas; och treonin 17, med Ca2+-kalmodulinberoende proteinkinas.23 varje fosforylering är associerad med stimulering av de initiala hastigheterna för hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ upptag, vilket huvudsakligen uttalas vid låg, vilket resulterar i en total ökning av affiniteten hos Ca2+ – pumpen för Ca2+.45 på grundval av dessa observationer antogs det ursprungligen att fosforylerad fosfolamban fungerar som en stimulator för det hjärt-sarkoplasmatiska retiklet Ca2+ – ATPas (SERCA2) enzymet. I slutet av 1980-talet inträffade emellertid ett signifikant genombrott som visade att defosforylerad fosfolamban faktiskt är en hämmare av hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ transport för Ca2+ och att fosforylering lindrar denna hämmande effekt, vilket ger upphov till fosforyleringsinducerad stimulering.6 Detta resultat, tillsammans med identifieringen av ett hjärt–sarkoplasmiskt retikulumassocierat proteinfosfatas som kan defosforyla fosfolamban,7 har lett till vår nuvarande förståelse av fosfolamban som en reversibel hämmare av hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPas-aktivitet.

Fosfolamban fosforyleras också in situ under den adrenerga stimuleringen av adrenerga hormoner. Studier i intakta slaghjärtor eller isolerade hjärtmyocyter har visat att både serin 16 och treonin 17 i fosfolamban fosforyleras under isoproterenolstimulering.89 fosforylering av fosfolamban och de åtföljande ökningarna i hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ upptagningshastigheter föreslogs vara åtminstone delvis ansvariga för de stimulerande effekterna av bukspottkörtel-agonister i däggdjurshjärtat.

strukturella egenskaper hos Fosfolamban

strukturen för fosfolamban är för närvarande inte känd, men baserat på dess aminosyrasekvens har flera modeller föreslagits. Det är allmänt accepterat att det finns två stora domäner: en hydrofil domän (AA 1-30, vilket indikerar aminosyrarester 1 till 30), som innehåller de tre fosforyleringsställena, och en hydrofob domän (AA 31-52), som är förankrad i hjärt sarkoplasmatisk retikulummembran. En del av den hydrofila domänen har föreslagits vara i en spiralformad konfiguration, och fosforylering av fosfolamban kan varva ner eller störa denna strukturella konfiguration.10 bevis från flera laboratorier indikerade vikten av den hydrofila domänen för att förmedla de regulatoriska effekterna av fosfolamban på hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ pump.6111213 faktiskt har AA 2-18 i fosfolamban föreslagits att interagera med AA 336-412 och 467-762 i SERCA2 för funktionell modifiering.14

den hydrofoba domänen för fosfolamban har också föreslagits ha en spiralformad struktur. Det finns för närvarande inga tydliga bevis för att denna domän interagerar med hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ pump, även om flera studier har föreslagit att den hydrofoba delen av fosfolamban också är viktig för att förmedla de reglerande effekterna.1215-cysteinrester i den transmembranska domänen i AUC-Spiral tillhandahåller icke-kovalent interaktion mellan monomera former och bidrar till stabilisering av en pentamerisk struktur för fosfolamban.16 analys av fosfolambanpentamerer indikerade att pentamerbildning var den hos en vänsterhänt spiralformad spiralbunt med en cylindrisk jonpor.17 nya bevis visade att en leucin dragkedja stabiliserar fosfolamban pentameric association och bildar en central jonpor,18 som kan möjliggöra Ca2+-selektiv jonöverföring.19 Det är emellertid inte för närvarande klart om pentamerisk montering är väsentlig för funktionell reglering av hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPas. Expressionsstudier i cellfria system har visat att de monomera och pentamera formerna av fosfolamban är lika effektiva för att förmedla de regulatoriska effekterna på Ca2+ – pumpen.14

en annan teori om fosfolamban–Ca2+-ATPas-interaktion föreslog en dimerisk förening av Ca2 + – pumpproteinerna runt en fosfolambanpentamer.20 Denna modell, baserad på tidsupplöst fosforescensanisotropi, beskrev en preferensinteraktion mellan den Ca2+-fria pumpen och defosforylerad fosfolamban. Fosfolambanfosforylering destabiliserade interaktionen och resulterade i ökad rotationsmobilitet hos Ca2+-ATPas i hjärt sarkoplasmatisk retikulummembran.20

reglering av Basal myokardiell kontraktilitet av Fosfolamban

fosfolambans roll vid reglering av basal myokardiell kontraktilitet har nyligen belysts genom utveckling av en fosfolamban-bristfällig mus.21 dessa möss, skapade med hjälp av genmålningsmetodik i murina embryonala stamceller, visade hyperdynamisk hjärtfunktion, inklusive ökad systolisk funktion, ökade frekvenser av vänster ventrikulär avkoppling,21 och förbättrad ventrikulär fyllning.22 Fosfolambanbristande hjärtan slappnade inte bara av snabbare än hjärtan av vildtyp utan uppvisade också förbättrade inotropa parametrar, inklusive ökade tryckutvecklingshastigheter, som bedömdes i arbetspresterande beredningar21 och in vivo, med hjälp av ekokardiografiska analyser.22 dessa fynd underbyggdes genom in vitro-analyser av isolerade ventrikulära kardiomyocyter från fosfolambanbristande hjärtan, som också uppvisade förbättring av relengthening, förkortning och Ca2+ kinetik.23 de förbättrade kontraktila parametrarna återspeglade subcellulära förändringar vid hjärt-sarkoplasmatisk retikulumnivå. Affiniteten hos Ca2 + – pumpen för Ca2 + ökade signifikant, och detta var förknippat med ökat intraluminalt hjärta sarkoplasmiskt retikulum Ca2+-innehåll i fosfolambanbristande hjärtan jämfört med hjärtan av vildtyp.21

den funktionella betydelsen av fosfolamban vid reglering av hjärtkontraktilitet har underbyggts ytterligare i studier av fosfolamban heterozygota möss, som endast innehåller en fosfolambaninriktad allel.24 hjärtan hos dessa möss uttrycker 40% av fosfolambannivåerna som finns i mush hjärtan av vildtyp, och detta reducerade fosfolambanuttryck är förknippat med ökningar i affiniteten hos hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ transportsystem för Ca2+ och ökningar i kontraktila parametrar. Det är intressant att notera att när nivåerna av fosfolamban i vildtypen, fosfolamban-heterozygot och fosfolambanbristande hjärtan plottades mot sammandragningsgraden och avslappningen för dessa hjärtan observerades en nära linjär korrelation (Fig 1), vilket tyder på en framträdande roll för fosfolamban i regleringen av de basala kontraktila parametrarna i däggdjurshjärtat. Eftersom nivåerna av hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPas inte påverkades i dessa genetiskt förändrade hjärtan,indikerar 25 dessa data att förändringar i fosfolambannivåer, vilket kan återspegla förändringar i den relativa stökiometrin hos fosfolamban till hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPas, är associerade med parallella förändringar i hjärtkontraktila parametrar. Emellertid är den funktionella stökiometrin av fosfolamban till hjärt-sarkoplasmatisk retikulum Ca2 + ATPas för närvarande inte känd. In vitro-studier har rapporterat värden som varierar mellan 1: 5 och 5:1 för fosfolamban / SERCA2. In vivo-studier med transgena möss, som överuttrycker fosfolamban specifikt i hjärtat, föreslog att ”funktionell stökiometri” av fosfolamban/SERCA2 är mindre än 1:1 i infödda hjärt-sarkoplasmiska retikulummembran.26 fosfolambanproteinnivåerna i hjärtan från dessa transgena möss var dubbelt högre jämfört med vildtypshjärtan, och det ökade fosfolambanuttrycket resulterade i ökad hämning av Ca2+-ATPas-affiniteten för Ca2+, utan några effekter på Vmax för detta enzym.26 vidare, när de relativa nivåerna av fosfolamban till hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPas plottades mot EC50-värdena för Ca2 + – ATPas för Ca2 + i fosfolamban-överuttryck, vildtyp, fosfolamban-heterozygot och fosfolamban-bristfälliga hjärtan, observerades en nära linjär korrelation (Fig 2), vilket indikerar att den överuttryckta fosfolamban i de transgena hjärtan var funktionellt kopplad till Ca2+-ATPas. Den minskade affiniteten hos Ca2 + – ATPas för Ca2 + i fosfolamban-överuttryckshjärtan var associerad med minskningar i kontraktila parametrar och depression av Ca2+-transienterna i isolerade hjärtmyocyter jämfört med myocyter från vildtypshjärtan.26 ekokardiografiska analyser av hjärtan från dessa transgena möss visade signifikant undertryckt fraktionerad förkortning och omkretsförkortning jämfört med hjärtan från vildtypsmöss.26 sammantaget indikerar dessa studier på genetiskt förändrade möss att fosfolamban är en potent repressor av både sammandragnings-och avslappningsparametrar i däggdjurshjärtat.

Fosfolambans roll i myokardiell Macau-adrenerg respons

studier i isolerade slående hjärtan och hjärtmyocyter har visat att katekolaminadministrering resulterar i fosforylering av fosfolamban i hjärt-sarkoplasmatisk retikulum, fosfolemman i sarkolemmala membran och troponin I-och C-protein i myofibriller. Fosforylerings-/defosforyleringsreaktionerna på fosfolamban verkar emellertid vara snabbare än för de andra fosfoproteinerna, och fosfolamban har föreslagits vara en framträdande medlare av de bronkialadrenerga svaren i däggdjurshjärtat. Fosforylering av fosfolamban, som svar på ökningar av cAMP-nivåer under administrering av en agonist, åtföljs av en ökning av aktiviteten hos det hjärt-sarkoplasmatiska retiklet Ca2+ transportsystemet och en ökning av hjärtrelaxationshastigheten.272829 de ökade hastigheterna för Ca2 + upptag leder till ökad hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ sekvestreringsnivåer, som är tillgängliga för efterföljande sammandragningar, vilket leder till ökad kontraktil kraft. Fosfolamban fosforyleras emellertid inte bara av cAMP-beroende proteinkinas på serin 16 utan också av Ca2+-kalmodulinproteinkinas på treonin 17,89 och det relativa bidraget från varje fosforylering i de inotropa och lusitropa effekterna av kakor-agonister är för närvarande inte känt.

den funktionella rollen av fosfolamban i den adrenerga signaleringsvägen för adrenerga har nyligen klargjorts med hjälp av den fosfolambanbristande musen. In vitro-studier på isolerade myocyter och hjärtpreparat från dessa möss indikerade signifikant dämpning av de inotropa och lusitropa effekterna av isoproterenol jämfört med vilda preparat.2123 vidare in vivo-studier med användning av ekokardiografiska analyser av fosfolambanablaterade hjärtan visade att de aterosklerotiska adrenerga stimulerande effekterna också dämpades i det intakta djuret.22 således, även om fosfolamban inte är det enda proteinet som är involverat i transduktionen av hjärtactui-adrenerg signalering, indikerar de experimentella bevisen hittills att det är en viktig. Funktionen av fosfolamban under katekolamin stimulering av hjärtat antyder en roll för detta protein som en inre ”bromsmekanism”, som möjliggör snabb myokardiell reaktion, så att när adrenalin frigörs vid en ”kamp eller flykt” – situation, fosfolamban ”bromsen” lindras, vilket möjliggör snabba ökningar av hjärtkontraktion och avkoppling.

reglering av Fosfolambanuttryck

Fosfolamban är produkten av en enda gen, och den har klonats från flera arter inklusive gris, kyckling, mus och människa. Det finns > 96% homologi mellan kodande regioner av fosfolambangenen bland dessa arter, och det har hittills inte upptäckts några isoformer av fosfolamban.30 fosfolambangenen har kartlagts till human kromosom 6.31 studier på mus har visat att med avseende på cirkulationssystemet uttrycks fosfolamban differentiellt, allt från höga uttrycksnivåer i ventrikulär muskel till mellanliggande nivåer i förmaks-och lungmuskelmuskler och till låga men funktionellt signifikanta uttrycksnivåer i aorta glatt muskel. Differentiella nivåer av fosfolambanuttryck i ventrikulära och atriella fack tycktes korrelera med skillnader i kontraktila parametrar för dessa muskler.32

Fosfolambanuttryck har också visat sig regleras under utveckling och åldrande. Ökningar av fosfolambanuttryck under hjärtutvecklingen har observerats hos mus, kyckling, råtta och kanin.31323334 vidare har minskningar i fosfolambanfosforylering i det åldrande råtthjärtat föreslagits vara associerade med minskade kontraktila svar från dessa hjärtan på katekolaminstimulering.33

Myokardiellt fosfolambanuttryck har också visat sig regleras av sköldkörtelstatus hos både råtta och kanin.3435 under hypotyreos ändrades inte fosfolamban-mRNA-nivåerna i kaninatrium och ventrikel, medan fosfolamban-proteinnivåerna visade sig öka i råtthjärtan. Dessa förhöjda nivåer av fosfolamban i råtthjärtat var associerade med minskade hastigheter av hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ upptag, överensstämmande med ökad hämning av hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ pump och minskad kontraktilitet.34 motsatta regulatoriska effekter observerades för fosfolambanuttryck under hypertyreoidism.3435 hypertyreoidism var associerad med minskade nivåer av fosfolamban mRNA i kanin atria och ventriklar och minskade nivåer av fosfolambanprotein i råtthjärtan. Minskningarna i fosfolambannivåer återspeglades av ökade hastigheter av hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ upptag, i överensstämmelse med disinhibition av Ca2+ – pumpen och förbättring av kontraktila parametrar.

nya undersökningar av förändringar i genuttryck, som inträffar under hjärtsvikt, indikerade att förändringar i det relativa förhållandet mellan fosfolamban och Sr Ca2+ ATPas kan vara ett kännetecken för denna sjukdom.363738 det finns emellertid viss skillnad i litteraturen om hur fosfolambanuttryck förändras under hjärtinfarkt. Vissa studier utförda i sviktande mänskliga hjärtan har visat minskningar av fosfolamban mRNA37 eller fosfolambanprotein, 363738 medan andra studier observerade inga uppenbara förändringar i fosfolambannivåer av sviktande mänskliga hjärtan.39404142 även om det fortfarande finns kontroverser med avseende på fosfolambanförändringar under hjärtsvikt, är det uppenbart att intracellulära förändringar, som är förknippade med förtryck av hjärtkontraktilitet, tyder på en roll av fosfolamban i sjukdomens etiologi.

sammanfattning

vår förståelse av fosfolambans roll i hjärtfysiologi har utvecklats under de senaste två decennierna till den punkt där detta protein nu förstås vara en kritisk repressor av myokardiell kontraktilitet. Fosfolamban, genom dess hämmande effekter på affiniteten hos hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ pump för Ca2+, undertrycker både avslappningsgraden och sammandragningen i däggdjurshjärtat. Dessa hämmande effekter kan lindras genom (1) fosfolambanfosforylering, (2) nedreglering av fosfolambangenuttryck och (3) störning av fosfolamban–Ca2+-ATPas-interaktionen. Således kan genetiska tillvägagångssätt och farmakologiska ingrepp, utformade för att lindra fosfolambanhämmande verkan på hjärt sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ pump och myokardiell avkoppling, vara värdefull för att vända effekterna av flera sjukdomar i däggdjurshjärtat. Sådana ingrepp kan utformas för att hämma fosfolambanfosfatas, stabilisera fosforylerat tillstånd av fosfolamban, avbryta fosfolamban-Ca2+-ATPas-interaktionen, minska fosfolambantranskription eller störa fosfolamban mRNA-stabilitet. Utveckling av sådana terapeutiska strategier för att rikta fosfolamban kommer att vara ett viktigt framtida mål för klinisk förbättring av kontraktilitet i det misslyckade hjärtat.

fotnoter