resultat

Vi studerade vildtyp (WT), heterozygot V2RV31R/WT och homozygot v2r31r/V2R31R-möss. De mutanta mössen hade normala antal och frekvenser av mogna mjält-T-celler och tymocyter vid varje utvecklingsstadium. På grund av avsaknaden av kongena markörer kan TCR-proteiner inte identifieras av allelen som kodar för dem, och inte heller om de inkluderar C-regioner i enlighet med C-Områden1 mot C-regioner i enlighet med C-Områden2. Således utförde vi flödescytometri med användning av anti-V2-och anti-V31-antikroppar för att kvantifiera celler som uttrycker V2+ och V31+ TCR-Tuberkulosproteiner. Vi analyserade CD4 + och CD8 + single-positive (SP) tymocyter eftersom de är mogna och naiva T-celler i T-celler. Reflekterande publicerade data (8, 9) upptäckte vi en liten fraktion (0,11%) av celler som färgades med båda antikropparna i WT-möss (Fig. 1 B och C), vilket är förenligt med en liten population av V2 + V31 + T-celler i T-celler. Vi observerade en 12,4-faldig ökad fraktion av dessa celler i v2r31r/WT-möss och en 32,8-faldig ökning av v2r31r/V2R31R-möss (Fig. 1 B och C). Dessa förhöjda frekvenser av dubbla TCR-celler + motsvarar de större användningarna av V2 och V31 i uttryckta TCR-kedjor (Fig. 1 D-F). Dessa data visar att förbättring av RSS-kvaliteten på två V-kakor på samma allel ökar deras omarrangemang och följaktligen fraktionen av T-celler som uttrycker två distinkta typer av TCR-kakor proteiner. Eftersom v-repertoaren av sp-tymocyter återspeglar de relativa nivåer som enskilda V-segment rekombinerar (10), visar den förmånliga användningen av V31 över V2 att V31R konkurrerar ut V2R för omarrangemang. Detta kan bero på ökad tillgänglighet av V31 (11) eller interaktion i V31 med Dß–Jß segment före TCRß locus kontraktion platser V2 nära Dß–Jß segment. I synnerhet innebär den högre än dubbla ökningen av dessa Dual-TCR-celler i V2r31r/V2R31R-möss jämfört med v2r31r/WT-möss att två distinkta V(D)J-omarrangemang kan bidra till TCR-uttrycket från samma allel.

för Att avgöra om en enskild TCRß allel kan verkligen stödja uttryck för TCRß proteiner från två olika V(D)Jß omorganiseringar, analyserade vi möss där man TCRß-allelen är inaktiverad av radering av TCRß förstärkare (Eß) (12, 13). Vi analyserade möss som bär den e-borttagna allelen mittemot en WT-allel, en allel med en RSS-ersättning av antingen V2 (V2R) eller V31 (V31R) eller båda (8). Vi upptäckte en liten procentandel (0,094%) av V2+V31+ SP-tymocyter i WT/e-möss (fig. 2 A och B), som potentiellt representerar en sällsynt population av celler som uttrycker två olika TCR-Tuberkulosproteiner från samma WT-allel. Oavsett observerade vi v2+ V31 + – celler vid en 1,9-faldig högre frekvens i V2R / e-Möss och vid en 4,8-faldig högre frekvens i V31r/e-möss (Fig. 2 A och B). Således, förbättra kvaliteten på antingen v Bisexuell RSS höjer fraktionen av celler som uttrycker både V2 + och V31+ TCR Bisexuell proteiner. I synnerhet upptäckte vi en 14,4-faldig ökad frekvens av V2 + V31 + – celler i V2rv31r/e-möss i förhållande till WT / e-möss (Fig. 2 A och B), vilket indikerar att förbättrad kvalitet på två V-RSS-enheter för två V-RSS ökar synergistiskt procentandelen celler som uttrycker både V2+ och V31+ TCR-proteiner för TCR. Faktum är att ta bort en del av V31 RSS på V2R-allelen (V2R31 OSKYL-allelen; Fig. 2C) reducerar dramatiskt frekvensen av V2+ V31 + celler till nivåer som är ekvivalenta eller mindre än den i V2R/e-möss (0,178% mot 0,135%; fig. 2 A och B). Sammantaget bekräftar dessa data att v2r31r-allelen främjar uttryck av två distinkta TCR-Tuberkulosproteiner från två olika v(D)j-omarrangemang på en enda allel.

vår studie visar att en inneboende genetisk mekanism styr monogenisk TCR-sammansättning och uttryck. Vi visar att lågkvalitativa V-RSSs samarbetar för att begränsa montering och uttryck av två distinkta TCR-gener från en allel. Vi har tidigare visat att dålig kvalitet V RSSs RSSs stokastiskt begränsa V Rekombinationsfrekvensen för rekombination före återkopplingshämning för att minska biallelisk montering och uttryck av TCR-gener (8). Vi drar nu vidare slutsatsen att lågkvalitativa V-RSSs-RSS också sänker förekomsten att både V31 och en uppströms V-RSS rekombineras på samma allel. Dessa omstruktureringar kan innebära att antingen 1) en deletional V2 ombildning till Dß1–Jß1–Cß1 cluster och en inversional V31 ombildning till Dß2–Jß2–Cß2 kluster, eller 2) en inversional V31 ombildning till Dß1–Jß1–Cß1 kluster, som inverterar en del av banan som innehåller Dß2–Jß2–Cß2 kluster och sedan en inversional V2 ombildning till Dß2–Jß2–Cß2 kluster (7) (Fig. 2D). För att uppnå monogenisk TCR-sammansättning och-uttryck kan denna RSS-baserade genetiska mekanism fungera med epigenetiska processer som har varit inblandade för att genomdriva monoallelisk V-rekombination. Det har till exempel föreslagits att dynamisk interaktion av Vß segment med kärnkraft lamina sänker Vß rekombination effektivitet genom att undertrycka Vß kromatin tillgänglighet och kromosom slingor mellan Dß–Jß kluster och uppströms Vß segment (14, 15). I detta sammanhang, dålig kvalitet Vß Lol skulle kunna sänka sannolikheten för att två Vß omorganiseringar sker på en allel när V31 och en uppströms Vß segment är både tillgänglig och uppströms Vß loopas i närheten med Dß–Jß segment. Således kan egenskaperna hos RSSs ligga till grund för monogenic montering och uttryck av däggdjur tcry, TCR Aci, och Ig Aci proteiner i däggdjur, och IG proteiner i broskfisk. Dessutom kan V RSSs på liknande sätt bidra till Igk-och Ig-Isotypisk uteslutning i B-celler.