försökspersoner, kliniska prover och HLA-genotypning. Alla ämnen med en historia av blodtransfusion uteslöts från studien. Trettiotvå familjer med en historia av simplex sklerodermi rekryterades och studerades för HLA klass II och klass i-alleler; 3 generationer studerades för 20 familjer och 2 generationer för 12 familjer. Tre generationer krävdes för studieinträde för alla kvinnor med barn, och deltagande av alla barn krävdes eftersom mikrochimerism kunde härledas från modern eller från ett barn i dessa ämnen. Deltagande av män, barn och aldrig gravida kvinnor inkluderade 2 generationer (dvs ämnet och mamman). En sklerodermipatient var en tvilling; den opåverkade tvillingen rekryterades också till studien. Trettiotre friska kontrollfamiljer rekryterades, inklusive 22 Med 3 generationer och 11 med 2 generationer. HLA-genotypning slutfördes för totalt 254 individer: 128 i sklerodermifamiljer och 126 i kontroller. Några ytterligare familjemedlemmar inkluderades för att bekräfta HLA-haplotypuppdrag. Från denna databas valdes ämnen för vidare studier när ämnets mor hade en icke-delad HLA-allel som riktades mot HLA-specifika analyser. Alla ämnen beviljade informerat samtycke som godkänts av Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board.

Pbmc isolerades från helhepariniserat blod genom utspädning i HBSS, följt av ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) gradientcentrifugering vid 1,077 g/mL. För vissa barn extraherades DNA från hårrötter för HLA-typning som beskrivits tidigare (9). Genomiskt DNA extraherades från Pbmc med hjälp av ett Isoquick Nucleic Extraction Kit (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), enligt tillverkarens instruktioner, och resuspended i 10 mM Tris-HCl (pH 9.0). DNA-kvantitet och renhet bestämdes med standardspektrofotometriska metoder. För vissa ämnen extraherades DNA direkt från helblodsprover.

DNA – baserad typning med sekvensspecifika oligonukleotidsondpaneler användes för att identifiera specifika alleler vid DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 och DQB1 loci. För DRB1 upptäcker en initial lågupplösningsanalys DRB1-familjer DBR1 * 01 till DRB1*14 och följs av 1 eller flera högupplösta analyser som identifierar specifika DRB1-alleler som beskrivits tidigare (10, 11). Dqa1-och dqb1-alleler bestämdes med användning av metoder som liknar de som beskrivits tidigare (9), med ytterligare sonder tillsatta för att detektera nyligen identifierade alleler (12). HLA klass i-antigener bestämdes med användning av en standard lymfocytotoxicitetsanalys som diskriminerar 20 HLA-a, 30 HLA-B och 8 HLA-Cw-antigener. Vissa prover utsattes för sekvensering för att bestämma specifika HLA – klass i-alleler (13). För att bekräfta HLA-allel-och antigentilldelningar och homozygositet genotypades flera familjemedlemmar — inklusive fäder och syskon till försökspersoner, när de var tillgängliga.

HLA-specifika PCR-primrar. Primersekvenser designades baserat på alla kända allelsekvenser (12). Primersyntes gjordes av Oligos etc. (Wilsonville, Oregon, USA). En primeruppsättning utformades för att rikta sig mot en HLA-klass i-polymorfism och 3 riktade HLA-klass II-polymorfismer. För att rikta HLA-B44 designades en primer som förstärker en grupp HLA-B-alleler baserade på polymorfismer vid positionerna 66, 69 och 75 i exon 3 och en annan grupp HLA-B-alleler baserade på en polymorfism vid position 229 i exon 3. Kombinationen av primers förstärker specifikt HLA-B44-alleler, vilket ger ett 190-bp-fragment. Alla DRB-specifika primrar utformades för att förstärka allelgrupper baserat på sekvenspolymorfismer i den hypervariabla regionen exon 2. För HLA-DRB5 * 01 förstärker en primer en grupp DRB5*01-alleler baserade på polymorfismer vid positionerna 25, 26, 31, 32 och 38, och den andra förstärker en grupp DRB5 * 01-alleler baserade på polymorfismer mellan positionerna 215 och 231. Kombinationen av primers förstärker specifikt HLA-DRB5*01-alleler, vilket ger ett 210-bp-fragment. För HLA-DRB1 * 04 förstärker en primer en grupp DRB1*04-alleler baserade på polymorfismer vid positionerna 25, 26, 31 och 36, och den andra förstärker en grupp DRB1 * 04-alleler baserade på polymorfier vid positionerna 97 och 110. Kombinationen av primers förstärker specifikt DRB1 * 04, vilket ger ett 104-bp-fragment. Ytterligare diskriminering bland DRB1 * 04-alleler uppnåddes genom att använda den tidigare primern tillsammans med 1 av 2 primers som diskriminerar en dimorfism vid position 258 (kodon 86), vilket ger ett 263-bp-fragment. För HLA-DRB1 * 11 förstärker en primer en grupp DRB1 * 11-alleler baserade på polymorfismer vid positioner 25, 26, 28, 30, 31, 32, och 35 av exon 2, och den andra primern förstärker en grupp DRB1*11-alleler baserade på polymorfismer vid positionerna 173 och 174 av exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR–reaktioner utfördes i en volym av 50 occl innehållande 1,25-1,5 occlg genomiskt DNA, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% WT/vol gelatin, 260 occmol/l av varje deoxynukleotid, 0,5 U perfekt Match PCR förstärkare (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA), 2,5 U AmpliTaq guld DNA-polymeras (Perkin-Elmer applicerade Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) och 20 pmol av varje HLA-specifik primer. Ultrapure vatten tillsattes för att kompensera den slutliga volymen av 50 occoll. Förstärkningen bestod av 5 minuter vid 96°C, 35 cykler vid 95°C i 35 sekunder, och vid 65°C i 35 sekunder för HLA-B44 (58.5°C för DRB5*01; 72°C för DRB1*04; 64.5°C för DRB1*11), då 72°C under 1 minut, med en sista förlängning steg vid 72°C i 10 minuter. Optimal förstärkning, känslighet och specificitet uppnåddes genom titrering av MgCl2 och primerkoncentrationer, antal termocykler och glödgningstemperatur. Alla förstärkningar utfördes i en GeneAmp System 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Analyskänslighet bestämdes genom spikningsexperiment där mål-DNA späddes seriellt och tillsattes till en fast mängd Bakgrunds-DNA motsvarande alleler av ämnet. HLA– B44-och DRB5*01-specifika PCR-analyser kunde detektera minst 1 målcell i en bakgrund 500 000 celler; HLA-DRB1*04– och DRB1*11-specifika PCR-analyser kunde detektera minst 1 målcell i en bakgrund av 100 000 celler. Varje PCR-analys inkluderade följande kontroller: (a)en positiv kontroll av DNA från en cellinje med HLA – allelen av intresse (0,2-0,5 usci); (b) en positiv kontroll från patientens mor (0,2–0,5 kg); (c) negativa kontroller av DNA från en cellinje med samma HLA-alleler som patienten (1,25 kg och 0,35 kg); och (d) en negativ kontroll bestående av alla PCR-reagens utan DNA. PCR-produkter elektroforesades vid 100 V konstant spänning i 1 timme i 6% eller 8% prefabricerade TBE-geler med hjälp av en Novex Xcell II Mini-Cell (Novex, San Diego, Kalifornien, USA). Varje gel inkluderade positiva och negativa PCR-kontroller och en 100-bp-stege (SLL-100; Gensura, Del Mar, Kalifornien, USA). Geler färgades med silverfärg (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornien, USA) och torkas med DryEase Gel Drying System (Novex). DNA extraherat från helblod testades i 4 prover av otillräcklig mängd för att isolera Pbmc. Alla tester gjordes i två exemplar, och de flesta prover analyserades mer än en gång.

PCR försiktighetsåtgärder. Extrem försiktighet användes för att undvika och upptäcka eventuell PCR-kontaminering. Separata områden användes för pbmc-separation, extraktion av genomiskt DNA, PCR-inställning och amplifiering och analys av PCR-produkter, med före och efter PCR-tester utförda i separata laboratorier. Aerosolresistenta pipettspetsar (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Kalifornien, USA) användes i alla experiment, och flera negativa kontroller inkluderades i alla PCR-förstärkningar.

sekvensering av HLA-specifika PCR-produkter. Sju mikroliter av den initiala HLA-specifika PCR-produkten utsattes för ytterligare 40 förstärkningscykler med användning av de ursprungliga termocykelparametrarna. Trettio mikroliter av denna PCR-produkt elektroforesades i en 1,75% ultrapure agarosgel (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) och färgades med en lösning av etidiumbromid (0,5 kg/mL). Bandet skars ut, eluerades och renades med användning av en QIAquick Gel extraktion Kit (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornien, USA). Den renade PCR-produkten eluerades till 30 oktyl 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0) och 100 ng tillsattes till en reaktionsblandning innehållande 8,0 oktyl sekvenseringsreagens förblandning (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol 5 ’eller 3’ primer, och 1 Aci l DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Ultrapure vatten tillsattes för att göra en slutlig volym av 20 occoll. Sekvenseringsreaktionsblandningarna upphettades vid 96 CCB i 3 minuter i ett GeneAmp – system 9600 termocyklister, följt av 25 cykler vid 96 CCB i 10 sekunder, 50 CCB i 5 sekunder och 60 CCB i 4 minuter. Resulterande PCR-produkter kolonnrenades och elektroforesades enligt ovan. Sense-och antisense-sekvenser bestämdes i duplikat för patientens och moderns HLA-specifika PCR-produkter, såväl som för positiva kontrollcellinje-PCR-produkter. Sekvensanalys utfördes med hjälp av Wisconsin paketversion 9.1 programvara från Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA).

Cytospin slide beredning och in situ hybridisering. Cytospin slide preparat analyserades för närvaron av X-och Y-kromosomspecifika sekvenser, med användning av en teknik som utvecklats i Fred Hutchinson Cancer Research Center Molecular Cytogenetics Laboratory för kvantitativ analys av chimerism i kön-inkompatibla stamcellstransplantationspar (14). Cytospinprover av manliga celler framställdes genom centrifugering av 30,000–60,000 nyseparerade Pbmc på glasskivor, 300 oc per bild. Slides lagrades i en torkningskammare tills användning. Den X-kromosomspecifika sonden DXZ1 (15) var nick-översatt med digoxigenin, och den y–kromosomspecifika sonden DYZ1 (16) var nick-översatt med biotin. XY-sondblandningen hade en slutlig koncentration av 0,5 kg / mL av varje sond i hybridiseringsbuffert på 50% formamid, 2 kg SSC (0,3 m natriumklorid och 0,03 m natriumcitrat) och 10% dextransulfat. Den denaturerades vid 72 C i 5 minuter, kyldes på is och applicerades på bilden. Slides digererades i pepsin (0,1 mg/mL i 0.01 M HCl) vid 37 kcal C i 3 minuter, fixerad i 4% buffrad formalin i 15 minuter, sköljd i PBS, dehydratiserad i etanol (70%, 95% och 100%) och lufttorkad. Slides denaturerades genom behandling i 2 CCB (72 CCB) i 10 minuter, 70% formamid, 2 CCB (72 CCB) i 3 minuter, dehydratiserades i en etanolserie (-20 CCB) och lufttorkades. Tio mikroliter sond applicerades på bilden och monterades sedan under en täckglas (22 22 mm 22 mm) förseglad med gummicement. Den inkuberades över natten vid 42 kcal C i en fuktad kammare. Slides tvättades i 55% formamid, 2 msk SSC (45 msk C) under 15 minuter, och 2 msk SSC (rumstemperatur) under 5 minuter. Sondsignaler detekterades samtidigt med fluoresceinkopplad Anti-digoxigenin (1:500 utspädning; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) och Texas rödkopplad avidin (1: 500 utspädning; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien, USA) i 30 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Efter tvättning med 2 msk SSC och PBS monterades de med VECTASHIELD (Vector Laboratories). Diabilder utvärderades direkt med hjälp av ett Nikon E600 epifluorescensmikroskop med en 100-W kvicksilverlampa utrustad med lämpliga enkel -, dubbel-och trippelbandpassfilter. Endast celler med 2 synliga kromosomsignaler räknades upp, utan att använda någon elektronisk förbättring.