2.1 anaerob andning

under andning oxiderar olika membranassocierade dehydrogenaser vattenlösliga substrat och reducerar menakinon (MK) i membranet till menakinol. Under aeroba betingelser, elektronerna används för att reducera syre till vatten, medan under anaeroba betingelser, nitrat respiratorisk tillväxt elektroner överförs till nitrat för att ge nitrit (Fig. 5.1). En viktig elektrondonator av andning är NADH + H + producerad i glykolys och trikarboxylsyracykeln. Två typer av membranbundna NADH-dehydrogenaser, NDH-i och NDH-II, har beskrivits för bakterier för att katalysera oxidationen av NADH+H+ till NAD+ (Yagi, 1993). NDH-I består av 14 subenheter, kodade av nuo operon i Escherichia coli, och innehåller flavinmononukleotid (FMN) och flera järn–svavelkluster för att koppla elektronöverföring till protonpumpning över membranet. NDH-II består av en enda subenhet kodad av ndh-genen. NDH-II är inte ett integrerat membranprotein utan associerat med den inre sidan av det cytoplasmatiska membranet. Den innehåller flavin adenindinukleotid (FAD) som protesgrupp och elektronöverföring är inte kopplad till protontranslokation. I B. subtilis-genomet kodar tre gener, yjlD, yumboch yutJ potentiella NADH-dehydrogenaser av NDH-II-typen, medan en nuo-operon saknas från B. subtilis-genomet (Kunst et al., 1997). Yjld, bytt namn Ndh, består av 392 aminosyrarester och visar 29% sekvensidentitet till NDH-II av E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Intressant är mängden Ndh-protein av B. subtilis hittades signifikant reducerad under anaeroba förhållanden (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh verkar vara det huvudsakliga aeroba NADH-DEHYDROGENASET av B. subtilis, eftersom mutation av ndh-genen uppvisade en aerob tillväxtdefekt (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Under tiden visades det att uttrycket av yjlc-ndh-operonen regleras av Rex-regulatorn, en redoxavkännande transkriptionsregulator, som svarar på NADH/NAD+ – förhållandet (se även avsnitt 3.3) (Gyan et al., 2006). Däremot hittades uttrycket av yumB-genen inducerad under nitratandningsbetingelser i transkriptomstudier (E. H Auclurtig, opublicerade resultat). Huruvida YumB och YutJ har NADH-dehydrogenasaktivitet som föreslagits av proteinsekvenslikhet och om de är relevanta under nitratandningstillväxtförhållanden måste bestämmas.

liksom andra aeroba respiringorganismer har B. subtilis ett succinatdehydrogenas (sdh) eller mer exakt ett succinat:kinonoxidoreduktas, SQR (h Occlugerh Occull, 1997). Enzymkomplexet är en integrerad del av det cytoplasmatiska membranet i bakterier och det inre mitokondriella membranet i eukaryoter. Det katalyserar oxidationen av succinat till fumarat kopplat till reduktionen av kinon. Därigenom är enzymet en funktionell del av både citronsyracykeln och andningskedjan (H. O. C. O. C., Aasa, von Wachenfeldt, Hederstedt, 1992). SQR i B. subtilis minskar MK och har tre proteinunderenheter, SdhA, SdhB och SdhC. SdhA är ett flavoprotein med en kovalent bunden FAD som utför de två elektronoxidationen av succinat till fumarat i cytoplasman. SdhB innehåller tre järn-svavelkluster (, och ) som fungerar i elektronöverföring mellan flavingruppen och heme b av cytokrom b558 i SdhC. SdhC har fem transmembrana-spiralformade segment och förankrar SdhAB-dimeren på membranets cytoplasmatiska sida och fungerar i transmembranelektronöverföring till MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoy, Aasa, & Hederstedt, 2000). De två heme b-kofaktorerna förmedlar överföring av elektroner över det cytoplasmatiska membranet till den yttre sidan av membranet vid vilken MK reduceras och två protoner konsumeras (Hederstedt, 2002). Detta skiljer sig från E. coli där protonerna för reduktion av ubiquinon till ubiquinol konsumeras på den negativa sidan av membranet, vilket inte påverkar membranpotentialen. B. subtilis och andra baciller, såsom Bacillus megaterium och Bacillus cereus-stammar, kan växa under oxiska förhållanden med succinat som kol och energikälla (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium och B. cereus växer inte under anaeroba förhållanden i närvaro av glycerol. I samförstånd saknas gener för ett glycerol-3-dehydrogenas i genomerna. Emellertid detekterades en glpD-gen för den aeroba varianten av det membranlokaliserade elektronöverföringssystemet I B. subtilis. Ingen homologi hittades för gener som kodar för andra primära dehydrogenaser närvarande i E. coli, såsom olika formiatdehydrogenas, hydrogenaser, l-laktatdehydrogenas, d-aminosyradehydrogenas, malat:kinonoxidoreduktaser eller quinoproteinglukosdehydrogenas. Självklart har B. subtilis endast en begränsad uppsättning primära elektrondonerande dehydrogenaser, nämligen olika former av NDH-II och aerob glycerol-3-fosfatdehydrogenas.

under aeroba förhållanden överförs elektronerna från menakinol via cytokrom bc1-komplexet till AA3-typ cytokrom C-oxidas. Under mikroaerofilt tillstånd används cytokrom bd-typ menakinoloxidas med hög syreaffinitet. Fumarat som terminalelektronacceptor exkluderades för olika baciller, inklusive B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). Följaktligen finns inte gener för ett fumaratreduktas i B. subtilis-genomet. Andra bacilli-stammar, såsom Bacillus licheniformis och Bacillus circulans, kan andas fumarat som E. coli.

under anaeroba tillväxtförhållanden överför B. subtilis elektronerna uteslutande till respiratoriskt nitratreduktas. I bakterier klassificeras tre olika nitratreduktassystem: cytoplasmatiska assimilerande NAD(P)H-beroende nitratreduktaser (Nas), det membranbundna respiratoriska nitratreduktaset (Nar) och de periplasmiska dissimilatoriska nitratreduktaserna (Nap). Alla tre tillhör DMSO-reduktasfamiljen av proteiner och innehåller bis-molybdopterin guanindinukleotid (MGD) kofaktor (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). B. subtilis-genomet kodar bara för respiratoriskt nitratreduktas Nar. Nar-enzymer består vanligtvis av tre underenheter. Den stora subenheten NarG innehåller det aktiva stället med MGD-kofaktorn, en mindre löslig subenhet NarH har ett och tre centra, och subenheten Nari är ett cytokrom b. Nar är ett kinoloxidas och menakinolpoolen oxideras av cytokrom b-subenheten NarI. Två elektroner flyter via heme b av NarI till järn-svavelkluster av NarH och slutligen till cytoplasmatisk subenhet NarG som reducerar nitrat till nitrit. NarJ-proteinet ingår inte i enzymet utan krävs för slutmontering av det membranbundna enzymet (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). På grund av de olika platserna för kinoloxidation i periplasmen och för nitratreduktion i cytosolen bidrar nitratreduktas Nar till genereringen av en protongradient (Fig. 5.1). Nar-lokusen består av narGHJI operon (kodning av respiratorisk nitratreduktas), narK (för ett potentiellt nitritsträngsprutningsprotein), den öppna läsramen ywiC (med okänd funktion), arfM som kodar för modulatorn för anaerob andning och jäsning, och även genen för den anaeroba regulatorn Fnr (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

nitrit omvandlas sedan vidare till ammoniak av det assimilerande Nitritreduktaset NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Assimilerande eller ammoniumproducerande NADH-beroende NITRITREDUKTAS är ett siroheminnehållande enzym som katalyserar sexelektronreduktionen av nitrit till ammonium. Nitritreduktasgenerna nasDE var en del av en nasDEF-operon och hittades omedelbart nedströms nasBC-operonen, som kodar för NADH-beroende nitratreduktas (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).