Abstrakt

Myoepithelium är närvarande i canine mammary tumors som vilande och proliferativa suprabasala och spindel-och stellat interstitiella celler. Syftet med denna uppsats var att utvärdera en panel av markörer för identifiering av fyra olika myoepiteliala cell morfologiska typer i den normala och neoplastiska bröstkörteln och att undersöka immunhistokemiska förändringar från en epitel till en mesenkymalfenotyp. Cytokeratin 19 (CK19), cytokeratin 5/6 (CK5/6), cytokeratin 14 (CK14), östrogenreceptor (er), p63-protein, vimentin (VIM) och antikroppar mot glatt muskulatur (alfa-SMA) användes på 29 neoplasmer (3 godartade och 3 maligna myoepiteliala tumörer, 7 karcinom i godartade blandade tumörer och 16 komplexa karcinom) och på normal vävnad i bröstkörtlar. Alla dessa antikroppar testades också på 3 bröstvävnader från djur utan bröstpatologi. De myoepiteliala markörerna uttrycktes väl i de suprabasala cellerna och förlorades gradvis i de rörliga typerna, med stellatcellerna som endast behöll vim-uttryck typiskt för mesenkym. Er märkt några vilande och rörliga myoepitelceller. På grundval av våra resultat föreslår vi en övergång från myoepiteliala immotila celler till migrerande fibroblastliknande celler. Denna övergång och karakteriseringen av en immunhistokemisk panel för vilande och rörliga myoepiteliala celler kasta mer ljus på det biologiska beteendet hos myoepiteliala celler.

1. Introduktion

Bröstkörteltumörer hos hundar bildas av både epitel (epitel och myoepitel) och mesenkymala komponenter. Ursprunget för de mesenkymala cellerna diskuteras fortfarande. Den förhöjda frekvensen av tumörer som visar myoepitelial eller basalcellsproliferation är en unik egenskap hos tumörer hos hundar.

i den normala bröstkörteln avgränsas lumina av ett inre lager av polariserade epitelceller som vilar på två yttre eller basala lager av epitel-och myoepitelceller . Både basala och myoepiteliala celler syntetiserar källarmembranet i kanaler och alveoler och bildar en strukturell barriär mellan de luminala epitelcellerna och det omgivande stroma . I kanaler bildar myoepitelceller ett nästan kontinuerligt lager av celler orienterade parallellt med kanalernas långa axel. Detta skikt omger de luminala epitelcellerna och separerar dem från källarmembranet och stroma. I alveoler är myoepitelialcellerna diskontinuerliga och bildar ett korgliknande nätverk runt alveolerna, vilket gör att vissa luminala epitelceller kan kontakta källarmembranet direkt . Därför är myoepitheliet inte bara beläget i ett idealiskt läge för att kommunicera mellan dessa två fack, men det är också placerat för att ge viktiga reglerande signaler för upprätthållandet av normal cellstruktur .

baserat på immunhistokemi visar de tre skikten av celler i den normala bröstkörteln olika markörer: det luminala epitelet är märkt av CK19, och bascellerna och myoepitelialcellerna färgas av CK5/6 och CK14 och p63, Alfa-SMA och VIM . Myoepitelialceller är kontraktila element som uppvisar en kombinerad epitel-och glattmuskelimmunoprofil. Markörerna som nämns ovan uttrycks i cytoplasman, förutom p63 som är en kärnmarkör . Myoepitelialcellskiktet är den enda källan till tumörsuppressor p63, vilket hämmas signifikant vid proliferation och invasion av associerade tumörceller . Dessutom märks basala myoepitelialceller i den normala bröstkörteln ibland av er-antikropp, som används för molekylbaserad klassificering av tumörer i hundbröst .

distinkta myoepiteliala cellmorfologier kan kännas igen i hundkomplex och blandade tumörer: vilande och proliferativa suprabasala myoepiteliala celler och spindel-och stellatmotila interstitiella myoepiteliala celler. Suprabasala celler är belägna mellan källarmembranet och det luminala epitelet och uppvisar plattad spindel (vilande celler) eller polygonala morfologier (proliferativa celler). Interstitiella celler ordnas ofta i fasta bon som är avsedda för epitelelement eller isoleras i interstitium . Spindel-och stellat myoepitelialceller skiljer sig mot en mer allmän kontraktil fenotyp .

interstitiella myoepiteliala celler kan så småningom bli fibroblastliknande celler, vilket endast visar vim-immunreaktivitet . Den myoepiteliala differentieringen kan kulminera i bildandet av olika mesenkymala vävnader, inklusive brosk och ben i blandad tumör hos hundar.

förvärvet av typiska egenskaper hos mesenkymala celler kommer sannolikt att härröra genom epithelial-mesenkymal övergång (EMT). EMT är ett biologiskt fenomen som tillåter en polariserad epitelcell, som normalt interagerar med källarmembranet via sin basala yta, att genomgå flera biokemiska förändringar som gör det möjligt att anta egenskaper och funktioner hos mesenkymala celler .

detta dokument kommer att fokusera på olika aspekter av myoepiteliala celler och brösttumörer hos hundar, specifikt (1) karakterisering av de fyra olika myoepiteliala cell morfologiska typer i den normala och neoplastiska bröstkörteln med hjälp av en panel av antikroppar och (2) de immunhistokemiska förändringar i myoepiteliala celler från ett epitel till en mesenkymala fenotyp.

2. Material och metoder

2.1. Prover

Bröstkörtelprover av 29 kvinnliga hundar hämtades från databasen för den Anatomopatologiska tjänsten vid fakulteten för veterinärmedicin i Bologna. De ämnen som tillhörde olika raser: blandras (𝑛=13), schäfer (𝑛=3), Pudel (𝑛=3), Yorkshire Terrier (𝑛=3), Tax (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Pekare (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), och Siberian Husky (𝑛=1); de var alla kvinnor, med en genomsnittlig ålder på 9.20±2.28 år (medelvärde ± SD). Tumörerna bestod av: 3 godartade myoepiteliala tumörer, 3 maligna myoepiteliala tumörer, 7 karcinom i godartade blandade tumörer och 16 komplexa karcinom (de två sista grupperna differentierades genom närvaron av brosk och/eller ben i de blandade tumörerna). Dessutom utvärderades 29 prover från normala bröstkörtlar av samma tumörlinje och 3 bröstprover från 3 friska icke-bröstbärande honhundar.

tumörer klassificerades enligt Misdorp et al. och Goldschmidt et al. i godartade myoepiteliala tumörer: en sällsynt neoplasma bestående av myoepiteliala celler arrangerade i korta buntar blandade med ett extracellulärt fibrillärt basofilt material; maligna myoepiteliala tumörer: skiljer sig från den godartade varianten med mer polymorfa myoepiteliala celler; komplext karcinom: ett karcinom som består av både luminala epitel-och myoepiteliala komponenter; karcinom i godartad tumör: en tumör med foci av maligna epitelceller eller distinkta knölar av sådana celler som förekommer tillsammans med mesenkymala celler som har producerat brosk och/eller ben möjligen i kombination med fibrös vävnad.

2.2. Immunohistokemi

fyra tjocka sektioner av ACC skars från formalinfixerade paraffininbäddade block innehållande representativa tumörprover. Immunohistokemi för följande markörer gjordes på dessa vävnader: CK19, ER, CK5 / 6, CK14, vim, Alfa-SMA, p63.

sektioner avvaxades i toluen och rehydrerades. Endogent peroxidas blockerades genom nedsänkning i 0,3% väteperoxid i 20 minuter. Sektioner sköljdes sedan i Tris-buffert. Antigenhämtning utfördes med citratbuffert (2,1 g citronsyramonohydrat/liter destillerat vatten), pH 6,0 (förutom CK5/6 och ER, som använde EDTA, pH 8,0) och uppvärmning under två 5 min perioder i en mikrovågsugn vid 750 W, följt av kylning vid rumstemperatur i 20 min. De primära antikropparna sammanfattas i Tabell 1. Alla primära antikroppar inkuberades över natten vid 4 msk C, följt av en kommersiell streptavidin-biotin-peroxidasteknik (LSAB Kit, Dako, Amsterdam, Nederländerna). Diaminobensidin (0,05% för 10 min vid rumstemperatur) användes som kromogen. Slides motfärgades med Papanicolaous hematoxylin.

som en negativ kontroll ersattes den primära antikroppen med en irrelevant, isotypmatchad antikropp för kontroll för icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen. Positiva vävnadskontroller med samma IHC-protokoll inkluderade hund normal bröstkörtel (anti-CK19, -ER, -CK14, -VIM, Alfa-SMA, -p63 antikroppar) och hundhud (anti-CK5/6).

antalet positiva celler med varje markör beräknades semiquantitatively: – = inga färgade celler, 6 = mindre än 5% positiva celler, + = 5-50% positiva celler, ++ = mer än 50% positiva celler. Fall ansågs positiva för ER när kärnfärgning observerades i minst 5% tumörceller .

3. Resultat

fyra typer av myoepitelceller erkändes på grundval av deras morfologi. Den vilande subtypen uppvisade de långsträckta egenskaperna hos spindelceller i nära kontakt med luminala epitelceller såväl som prolifererande suprabasala celler som istället visade en polygonal form (Figur 1(A)). De interstitiella rörliga cellerna observerades både bildande bon (spindeltypen fodrade bon och stellatcellerna utgjorde bokärnan) och isolerades i interstitium (Figur 2(a)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

figur 1

suprabasala myoepiteliala celler: vilande (tunna pilar) och proliferativa (tjocka pilar) celler. Immunohistokemiskt uttryck av en panel av antikroppar applicerade av IHC, 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19-antikroppar som märker cytoplasman; (c) anti-er-antikroppar som märker kärnorna; (d) anti-CK 5/6-antikroppar som märker cytoplasman; (e) anti-CK14-antikroppar som märker cytoplasman; (f) Anti-vim-antikroppar som märker cytoplasman; (g) Anti-Alfa-SMA-antikroppar som märker det cytoplasmatiska membranet; (h) anti-p63-antikroppar som märker kärnorna.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) Anti-vim-antikroppar som märker cytoplasman; (g) Anti-Alfa-SMA-antikroppar som märker det cytoplasmatiska membranet; (h) anti-p63-antikroppar som märker kärnorna.

3.1. Normal bröstkörtel

i de 3 kontrollfallen märktes alla vilande och proliferativa suprabasala myoepiteliala celler av p63, CK14, Alfa-SMA och vim. Vila och proliferativa suprabasala myoepiteliala celler uttryckte inte CK19 i något av fallen.

3.2. Bröstvävnad från samma linje av brösttumören

i de 29 normala vävnaderna i samma linje som tumörerna märktes alla vilande och proliferativa suprabasala myoepitelialceller med p63, CK14, Alfa-SMA och vim. CK5 / 6 var positiv i alla utom fyra fall och ER upptäcktes i 12 fall. CK19-uttryck observerades endast i det luminala epitelet. Myoepiteliala rörliga interstitiella celler observerades inte. Alla resultat sammanfattas i Tabell 2.

3.3. Mammary Tumors

immunohistokemiska resultat för suprabasal (Figur 1) och rörliga celler (Figur 2) med användning av p63, CK14, CK5/6, CK19, Alfa-SMA, VIM och ER sammanfattas i Tabell 2. CK5 / 6 märkt: suprabasala vilande celler i 16 av de 29 Fallen (5 karcinom i godartade blandade tumörer och 11 komplexa karcinom). CK 5/6 märktes också proliferativa suprabasala och spindelmotila celler i 10 fall (3 karcinom i godartade blandade tumörer och 7 komplexa karcinom). Stellatmotila celler var närvarande i 25 fall (1 godartad myoepitelial tumör, 3 maligna myoepiteliala tumörer, 5 karcinom i godartade blandade tumörer och 15 komplexa karcinom) men var negativa för CK5/6. Brusk i bröstblandade tumörer var alltid negativ.

CK14 visade positivitet i 23 fall i vilande celler (med undantag för 1 komplext karcinom och godartade och maligna myoepiteliala tumörer), i 22 fall i proliferativa celler (6 karcinom i godartade blandade tumörer och 15 komplexa karcinom) med en trend att förlora uttrycket när dessa celler hade förvärvat den mer rörliga fenotypen av spindelceller (positiv i 2 godartade och 3 maligna myoepiteliala tumörer, 2 karcinom i godartade blandade tumörer och 2 komplexa karcinom). Kondrocyter av blandade tumörer var negativa.

VIM var positivt i suprabasala celler i de 23 fallen av karcinom i godartad tumör och komplex karcinom och i rörliga myoepitelceller i alla 29 fall. Stromalceller var positiva i alla fall. Brosk var vim-positivt i alla 7 karcinom i godartade blandade tumörer.

Alfa-SMA märkt vilande och proliferativa suprabasala myoepiteliala celler i 23 karcinom i godartade blandade tumörer och komplexa karcinom. Spindelcellerna i 10 Fall (5 karcinom i godartad blandad tumör och 5 komplexa karcinom) visade positivitet för Alfa-SMA. I varje fall, förutom två komplexa karcinom, var stellatceller negativa. Stroma visade positivitet i endast 6 fall (1 karcinom i godartad blandad tumör och 5 komplexa karcinom).

P63 detekterades i vilande och proliferativa suprabasala myoepiteliala celler i de 23 fallen av karcinom i godartad blandad tumör och komplex karcinom. Alla spindel-och stellatmotila celler var negativa. Stromala celler och brosk var negativa.

er-uttryck var närvarande i 11 suprabasala myoepiteliala celler (4 karcinom i godartade blandade tumörer och 7 komplexa karcinom); spindel-och stellatmotila celler var positiva i 9 fall (3 karcinom i godartade blandade tumörer och 6 komplexa karcinom). Brosk av blandade tumörer var negativ.

vilande och proliferativa suprabasala och spindel / stellatmotila myoepiteliala celler uttryckte inte CK19 i någon av de undersökta tumörerna. Brosk av blandade tumörer var också negativt för CK19.

4. Diskussion

baserat på resultaten från Gama et al. och Tateyama et al. finns fyra morfologiska typer av myoepitelceller närvarande i bröstkörteln: vila och proliferativa suprabasala myoepiteliala celler foder alveoler och kanaler och spindel och stellate interstitiella rörliga celler, som ligger i det interstitiella utrymmet där de kan ordnas i Bon. Myoepiteliala markörer, såsom p63, CK5/6, CK14, Alfa-SMA och VIM, visade sig vara värdefulla diagnostiska tillägg för att underlätta utvärderingen av komplexa och blandade proliferationer. CK19 anses vara guldstandardmarkören för luminal epitel och användes för att undvika feldiagnos med myoepitelceller. På grund av korsreaktivitetsmönster och det faktum att lesionsfoci vanligtvis är små, åtnjöt ingen av myoepitelialmarkörerna 100% känslighet och specificitet för myoepitelialceller. Som sådan bör minst 2 markörer användas för att utvärdera ett visst fokus .

baserat på våra resultat var den bästa markören för suprabasala celler p63 speciellt i samband med CK14, som var begränsad till mogna (basala) myoepitelceller och i mindre utsträckning följt av CK5/6, Alfa-SMA och Vim (Figur 1). CK5 / 6 markerade emellertid också luminala epitelceller som gör det svårt att skilja dem från proliferativa suprabasala myoepiteliala celler . Morfologiskt kan både epitel-och myoepitelceller ha en polygonal form. Ett kännetecken för både CK14 och CK5/6, men inte för p63, Alfa-SMA och VIM, var deras reducerade uttryck i myoepitelialceller i det suprabasala proliferativa tillståndet. CK14, CK5 / 6 och p63-uttryck förlorades gradvis i celler i spindel-och stellatmotilt tillstånd.

Alfa-SMA och Vim var närvarande i spindelmotila myoepiteliala celler med olika intensitetsgrader. Endast VIM visade sig vara en konsekvent markör för stellatmotila myoepitelceller. I denna studie arrangerades det stellatmotila myoepitelet i Bon och fodrades av vilande celler förmodligen av alveolärt ursprung. Denna funktion kan stödja tanken att boet av stellatmotila myoepiteliala celler, som har förlorat uttrycket av de viktigaste myoepiteliala suprabasala markörerna, men behållit affinitet för VIM, är föregångarna till brosk, vilket indikerar att dessa celler har slutfört sin omvandling till mesenkymala element. I benigna och maligna myoepiteliala tumörer, vim märkning i samtliga fall, förlust av alla andra suprabasala myoepiteliala markörer, och knappa positivitet till CK14 i spindelceller var ett tecken på en rådande uttryck av myoepitelium rörliga tillstånd och en möjlig passage från enkla myoepiteliala celler till mesenkymala fibroblaster.

i vår studie förstärktes bevis på myoepitelialcellerna som skiftade till en mesenkymal fenotyp, som visades av förlusten av CK14, CK5 / 6 och p63-uttryck, genom diskontinuerlig märkning av spindelceller för Alfa-SMA, en markör för både myoepitelialceller och myofibroblaster, som helt förlorades i stellatmotila celler som förmodligen har blivit fibroblaster.

ytterligare bekräftelsestudier av Tsuda et al. rapporterade förekomsten av myofibroblaster med rester av CK14-uttryck (beskrivs som ”konverterade myoepitelceller”). I de fall som undersöktes i den aktuella studien bleknade CK14 gradvis, vilket indikerar en förlust av (myo-)epitelfenotypen. Dessa resultat stöder EMT-hypotesen som involverar ett myoepitelialiknande tillstånd, som genomgår en myoepitelial mesenkymal övergång (MMT). Denna hypotes bekräftades hos hunden av G Askorrtner et al. who uppgav att i brösttumörer innebär ett av stegen i utvecklingen av mesenkymala celler uttrycket av typiska myoepiteliala egenskaper.

ett intressant resultat av den aktuella studien var positiviteten för ER som hittades i 12/29 suprabasala myoepitelceller och 9/29 stellatceller av karcinom i godartade blandade tumörer och komplexa karcinom. Två isoformer av er-receptorer har beskrivits, nämligen ER-XXL och er-XXL, den senare är den enda formen uttryckt i kärnorna i isolerade basala-myoepiteliala celler . Antikroppen som användes i den aktuella undersökningen var inkluderande av båda isoformerna: både luminala och basala/stellatceller märktes, förmodligen luminala celler av ER-XXL och basala/stellatceller av ER-XXL.

Sammanfattningsvis karakteriserades de suprabasala myoepiteliala cellerna väl av p63 och CK14 och i mindre utsträckning av den andra markören som användes. De rörliga myoepiteliala cellerna kännetecknas istället av Alfa-SMA och VIM och förlust av CK14, CK5/6 och p63 (Figur 2). Den föreliggande studien visade också ER i både luminal epitel och suprabasal / stellat myoepitelialceller (den senare i ungefär hälften av fallen) och att er-uttryck inte påverkas av vilande/rörlig fas. Därför, i seriella eller multistained sektioner, immunohistokemi till ER i kombination med p63 och CK14 kan tjäna för att undvika felaktig identifiering av luminal eller myoepithelial celler i hund brösttumörer. Trenden med bevarad Alfa-SMA och Vim-uttryck i spindelceller, och endast vim-positivitet i stellatmotila celler såväl som det minskade p63-uttrycket i båda rörliga typerna, stöder hypotesen om EMT som involverar ett myoepitelialiknande tillstånd i MMT. Spindelmotilcellen kan betraktas som en tidigare transformation än stellatcellen mot en mesenkymal fenotyp.

Författarbidrag

dessa författare bidrog lika mycket till detta arbete.

intressekonflikt

författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

bekräftelse

författarna tackar Anne Collins för att ha redigerat den engelska texten.

kompletterande material