Roll Neisseria meningitidis PorA och PorB uttryck i antimikrobiell känslighet | Company Pride
brev
Neisseria meningitidis kan orsaka potentiellt dödlig systemisk sjukdom. Tidig diagnos och snabb antimikrobiell intervention är avgörande för gynnsamma kliniska resultat. Antibiotikaresistens har rapporterats för penicilliner (1), tetracyklin (2) och sulfonamider (3), liksom kinoloner (4) och rifampin (5).
N. meningitidis uttrycker två huvudporiner, PorA och PorB, som är antigeniskt variabla mellan stammar och inom en stam, och PorA är fasvariabel (slumpmässig på/av-växling) (6). Neisseria gonorrhoeae uttrycker en enda porin, PorB. Förändringar i porin uttryck eller variant poriner förmedlar antibiotikaresistens i flera gramnegativa bakterier, inklusive N. gonorrhoeae (7,-10). I N. meningitidis ökar frånvaron av PorB resistens mot tetracyklin och cefsulodin in vitro (11). Poras roll i antimikrobiell resistens har inte rapporterats för meningokocken. Förutom den föreslagna rollen i immunflykt antog vi att fasvariabel PorA-uttryck kan ge en uppenbar mekanism för meningokocken att undvika antimikrobiella medel om PorA förmedlar antibiotikaupptag eller uteslutning. Vi genererade stammar som saknade PorA eller PorB och genomförde MIC-analyser. Vi testade också om förändrat PorA-uttryck väljs genom antimikrobiell exponering under mic-analysen.
porA-och porB-generna med flankerande sekvenser förstärktes från N. meningitidis stam MC58 och klonades till pGEM T-easy. Inverse PCR följt av självligering gav plasmider med interna deletioner och introducerade restriktionsställen. LacZ/Kanamycinkassetten (12) klonades in i den introducerade SmaI-platsen för den borttagna PorA-allelen, vilket gav plasmid pPorALacZKan. En kloramfenikolacetyltransferasgen förstärktes och klonades in i den introducerade bglii-platsen för den borttagna porB-allelen, i plasmid pPorB:CAT. PorA lacZ kan-eller porB::cat-konstruktionerna omvandlades till N. meningitidis-stam 2 (13) för att ge stammar 9 9 och 9 9. Allelisk ersättning av vildtyp porA-eller porB-alleler med den mutanta allelen bekräftades genom PCR och sekvensering, såväl som SDS-sida av Sarkosyl-extraherade yttre membranproteiner (Fig. 1A).
analys av porin uttryck under MIC-analys. (A) membranproteiner isolerades genom Sarkosylextraktion och 10 occyg separerades på 8 till 12% bis-Tris akrylamidgeler före coomassie-färgning. Körfält 1, 9; körfält 2, 9 9; körfält 3, 9 9. (B) prover från den sista brunnen som visade grumlighet pläterades på BHI-agar och immunoblottades med den PorA-specifika MAb MN14C11.6.
MIC bedömdes med buljongmikrodilutionsmetod i 96-brunnsplattor (14) med användning av bakterier som odlades över natten på kompletterad BHI-agar vid 37 kg C och subkulturerades skakning i cirka 4 timmar i bhi-buljong vid 37 kg C innan de justerades till cirka 5 kg 105 CFU/ml baserat på den optiska densiteten vid 600 nm (OD600). Efter tillsats av 50 oktyl till seriellt utspädda antibiotika registrerades Mic efter natttillväxt vid 37 oktyl C (Tabell 1) som de koncentrationer vid vilka ingen grumlighet observerades. Varje analys gjordes tre gånger, varje gång i tre exemplar. För varje behandling, Mikrofoner var identiska inom och mellan analyser.
tabell 1
mikrofoner för vildtyp och mutant N. meningitidis strainsa
| Antibiotikum | MIC (µg/ml) | ||
|---|---|---|---|
| ¢9 | ¢9ΔPorA | ¢9ΔPorB | |
| Cefotaxime | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 |
| Ceftazidim | 0.03125 | 0.03125 | 0.0625 |
| Cephalothin | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 |
| Ampicillin | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 |
| karbenicillin | 0,0625 | 0,0625 | |
| kloxacillin | 1.25 | 1.25 | |
| penicillin G | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 |
| Piperacillin | 0.03125 | 0.03125 | 0.015625 |
| tetracyklin | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 |
| doxycyklin | 0.1875 | 0.1875 | 0.375 |
| Ciprofloxacin | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 |
| nalidixinsyra | 1.25 | 1.25 | |
| imipenem | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 |
| Rifampin | 0.125 | 0.125 | |
våra resultat bekräftade att förlust av meningokock PorB-uttryck ökar motståndet mot tetracyklin (11). Mutationer i PorB bidrar också till resistens mot tetracyklin i N. gonorrhoeae (9, 15). Rekommenderad kombinationsbehandling för multipliceringsresistent N. gonorrhoeae inkluderar injicerbar ceftriaxon och oral doxycyklin eller azitromycin (16). I detta sammanhang är det anmärkningsvärt att den meningokock-muterade stammen av den meningokock-9-typen av meningokock hade en minskad känslighet för doxycyklin. Vi noterade minskad känslighet för cephalothin för ¢9ΔPorB och även för cefalosporiner cefotaxime och ceftazidime. En tidigare rapport kopplade N. meningitidis PorB-mutation med ökad cefsulodinresistens (11). I N. gonorrhoeae, PorB loop 3-varianter bidrar också till förbättrad cefalosporinresistens (17). Vår bekräftelse på att Neisseria PorB modulerar cefalosporinkänslighet ökar möjligheten att minskning av mottagligheten för denna klass kan uppstå kliniskt eller underlättas av mutationer i PorB i antingen meningokocker eller gonokocker.
Fluorokinolonanvändning rekommenderas inte längre för gonokockinfektion (18), och punktmutationer i PorB1b av N. gonorrhoeae bidrar till minskad känslighet för N. gonorrhoeae för ciprofloxacin. Uttrycksförändringar i gonokock porin förändrar ciprofloxacinresistens (19); vi fann att mutation av meningokock PorB också resulterar i minskad ciprofloxacinkänslighet. Omvänt var denna stam mer mottaglig för rifampin, det andra stora valet för meningokockprofylax, kanske genom förändrad membranarkitektur, vilket har föreslagits för förändrad rifamycinresistens av kolistinresistent Acinetobacter baumannii (20).
I motsats, som vi observerade inga förändringar i känslighet i ¢9ΔPorA jämfört med den PorA+ förälder stam för något av de antibiotika som testades (Tabell 1). Detta tyder på att antingen PorA inte har någon direkt roll vid inträde av antimikrobiella medel i cellen eller att det finns val för reducerat PorA-uttryck via fasvariation under MIC-analysen, antingen i föräldrastammen eller i 2-årsåldern, vilket potentiellt maskerar PorA-medierad antibiotikainmatning. För att bedöma detta isolerade vi bakterier från den slutliga brunnen i vilken grumlighet observerades och bedömde PorA-uttryck genom koloniimmunoblotting med användning av anti-P1.7 Murin monoklonal antikropp (MAb) MN14C11.6 (erhållen från NIBSC, Storbritannien). Som kontroller jämfördes reaktiviteten mellan förälderstammen 2-9 och PorA mutantstammen 9-9. Detta visade att PorA-uttryck var oförändrat mellan kontrollbrunnar och efter exponering för något av de testade antimikrobiella ämnena (se Fig. 1b); sålunda, minskad känslighet för 9.
våra resultat överensstämmer med tidigare rapporter för en roll för N. meningitidis PorB i cefalosporiner och tetracyklinresistens (9, 11, 15). Parallellerna med gonokock PorB1b med avseende på antibiotikaresistens är slående. Att slå ut PorB-uttryck minskade också meningokockkänslighet för doxycyklin, en av de rekommenderade terapierna för multipliceringsresistent N. gonorrhoeae. Troublingly föreslår detta att selektivt tryck kan leda till uppkomst av gonokock Porbvarianter med reducerad doxycyklinkänslighet. Även om vi bara registrerade 2-faldiga skillnader som osannolikt isolerat leder till behandlingsfel, har synergin av PorB-variation med andra mutationer potential att expandera meningokock-och gonokockresistensspektrumet. Vi hittade inga bevis för en roll för PorA i antimikrobiell transitering över det yttre membranet.