aktivering av RNase H

RNase H är ett allestädes närvarande enzym som bryter ned RNA–strängen i en RNA-DNA-duplex. Det har identifierats i organismer så olika som virus och mänskliga celler (Crouch och Dirksen, 1985). Minst två klasser av RNAs H har identifierats i eukaryota celler. Flera enzymer med RNAs H-aktivitet har observerats i prokaryoter (Crouch och Dirksen, 1985). Även om RNAs H är involverat i DNA-replikation, kan det spela andra roller i cellen och finns i cytoplasman, såväl som kärnan (Crum et al., 1988). Koncentrationen av enzymet i kärnan tros emellertid vara större och en del av enzymet som finns i cytoplasmatiska preparat kan bero på kärnläckage.

de exakta igenkänningselementen för RNase H är inte kända. Det har emellertid visats att oligonukleotider med DNA-liknande egenskaper, så korta som tetramerer kan aktivera RNAs H (Donis-Keller, 1979). Förändringar i sockerpåverkan RNAs H-aktivering som sockermodifieringar som resulterar i RNA-liknande oligonukleotider, t.ex. 2′-fluoro eller 2′-metoxi verkar inte fungera som substrat för RNAs H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). Förändringar i orienteringen av sockret till basen kan också påverka RNAs h-aktivering, eftersom sackaroligonukleotider inte kan inducera RNAs H eller kan kräva parallell glödgning (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Dessutom påverkar ryggradsändringar förmågan hos oligonukleotider att aktivera RNAs H. Metylfosfonater aktiverar inte RNAs H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). Däremot är fosfortioater utmärkta substrat (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein och Cheng, 1993). Dessutom har chimära molekyler studerats som oligonukleotider som binder till RNA och aktiverar RNAs H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Till exempel oligonukleotider bestående av vingar av 2′-metoxifosfonater och ett fembasgap av deoxioligonukleotider binder till deras mål-RNA och aktiverar RNAs H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Vidare visades en enda ribonukleotid i en sekvens av deoxiribonukleotider vara tillräcklig för att tjäna som ett substrat för RNAs H när den binds till dess komplementära deoxioligonukleotid (Eder och Walder, 1991).

att det är möjligt att dra nytta av chimära oligonukleotider utformade för att aktivera RNAs H och ha större affinitet för deras RNA-receptorer och för att förbättra specificiteten har också visats (Giles och Tidd, 1992; Monia et al., 1993). I en studie var RNAs H-medierad klyvning av målavskrift mycket mer selektiv när deoxioligonukleotider bestående av metylfosfonatdeoxioligonukleotidvingar och fosfodiestergap jämfördes med fulla fosfodiesteroligonukleotider (Giles och Tidd, 1992).trots informationen om RNAs H och demonstrationen att många oligonukleotider kan aktivera RNAs H I lysat-och renade enzymanalyser är relativt lite ännu känt om rollen av strukturella egenskaper i RNA-mål vid aktivering av RNAs H (Minshull och Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder och Walder, 1988). Faktum är att direkt bevis på att RNAs h-aktivering faktiskt är verkningsmekanismen för oligonukleotider i celler har fram till nyligen saknats.

nya studier i våra laboratorier ger ytterligare, om än indirekta, insikter i dessa frågor. ISIS 1939 är ett 20 mer-fosforotioat komplementärt till en sekvens i den 3′-oöversatta regionen av ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Det hämmar ICAM-produktion i humana navelvenendotelceller och norra blottar visar att ICAM-1 mRNA snabbt bryts ned. En 2 ’ – metoxianalog av ISIS 1939 visar högre affinitet för RNA än fosfortioatet, är stabil i celler, men hämmar ICAM-1-proteinproduktionen mycket mindre potent än ISIS 1939. Det är troligt att ISIS 1939 destabiliserar RNA och aktiverar RNAs H. däremot hämmade ISIS 1570, ett 18-mer-fosforotioat som är komplementärt till translationsinitieringskodonet för ICAM-1-meddelandet produktion av proteinet, men orsakade ingen nedbrytning av RNA. Således hade två oligonukleotider som kan aktivera RNAs H olika effekter beroende på platsen i mRNA vid vilken de bundet (Chiang et al., 1991). En mer direkt demonstration av att RNAs H sannolikt är en nyckelfaktor i aktiviteten hos många antisensoligonukleotid tillhandahölls av studier där PCR med omvänd ligering användes för att identifiera klyvningsprodukter från bcrabl-mRNA i celler behandlade med fosforotioatooligonukleotider (Crooke et al., 1995).med tanke på den framväxande rollen av chimära oligonukleotider med modifieringar i 3′- och 5’-vingarna utformade för att förbättra affiniteten för mål-RNA och nukleasstabilitet och ett DNA-typgap för att fungera som ett substrat för RNAs H, studier fokuserade på att förstå effekterna av olika modifieringar på enzymets effektivitet är också av stor betydelse. I en sådan studie på E. coli RNAs H har vi rapporterat att enzymet visar minimal sekvensspecificitet och är processiv. När en chimär oligonukleotid med 2 ’- modifierade sockerarter i vingarna hybridiserades till RNA, var det initiala klyvningsstället nukleotiden intill metoxi-deoxikorsningen närmast 3 ’ – änden av RNA-substratet. Den initiala klyvningshastigheten ökade när DNA-gapets storlek ökade och enzymets effektivitet var betydligt mindre mot ett RNA-mål duplexerat med en chimär antisensoligonukleotid än en fullständig oligonukleotid av DNA-typ (Crooke et al., 1995).

i efterföljande studier har vi utvärderat interaktionerna mellan antisensoligonukleotider med strukturerade och ostrukturerade mål och effekterna av dessa interaktioner på RNase H mer detaljerat (Lima och Crooke, 1997). Med hjälp av en serie icke-klyvbara substrat och Michaelis-Menten-analyser kunde vi utvärdera både bindning och klyvning. Vi visade att i själva verket är E. coli RNAs H1 ett dubbelsträngat RNA-bindande protein. KD för RNA-duplexen var 1,6 occurm; Kd för en DNA-duplex var 176 occurm; och Kd för enkelsträngad DNA var 942 occurm. Däremot kunde enzymet bara klyva RNA i en RNA-DNA-duplex. Varje 2 ’- modifiering i antisensläkemedlet vid klyvningsstället hämmade klyvning, men signifikant laddningsreduktion och 2’-modifieringar tolererades vid bindningsstället. 2 ’ – propoxyamin) i antisensläkemedlet minskade affinitet och klyvning. Vi har också undersökt effekterna av antisensoligonukleotidinducerade RNA-strukturer på aktiviteten av E. coli RNAs H1 (Lima och Crooke, 1997). Vilken struktur som helst i duplexsubstratet befanns ha en signifikant negativ effekt på klyvningshastigheten. Vidare hämmades klyvning av utvalda platser helt, och detta förklarades av steriskt hinder som infördes av RNA-slingan som korsade antingen de mindre eller större spåren eller heteroduplexen. Nyligen har vi klonat och uttryckt humant RNAs H1. Proteinet är homologt med E. coli RNAs H1, men har egenskaper som liknar de som beskrivs för humant RNAs H typ 2 (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). Enzymet stimuleras av låga koncentrationer av Mg2+, hämmas av högre koncentrationer och hämmas av Mn2+ i närvaro av Mg2+. Det är 33 kDa i molekylvikt. Det är dubbelsträngat RNA-bindande protein och uppvisar unika positions-och sekvenspreferenser för klyvning (Wu et al., 1999). Dessutom har humant RNAs H2 klonats, men hittills har det uttryckta proteinet inte visat sig vara aktivt (Frank et al., 1998). Mycket nyligen har vi rapporterat om effekterna av flera mutationer införda i humant RNAs H1 på enzymets aktivitet (Wu et al., 2000). Således har vi nu de nödvändiga verktygen för att börja utforska rollerna för humant RNAs H i biologiska och farmakologiska processer och börja utveckla läkemedel som är utformade för att interagera med dem mer effektivt.

slutligen, åtminstone med avseende på RNAs H-inducerad nedbrytning av riktat RNA, har vi nyligen visat att i intervallet 1-150 kopior av RNA per cell har nivån av mål-RNA ingen effekt på antisensinhibitorns styrka (Miraglia, 2000). Detta beror på det faktum att antalet molekyler av antisensläkemedel per cell överstiger antalet kopior av RNA med flera storleksordningar. Således måste andra faktorer vara hastighetsbegränsande.