Lott valdes i första omgången (8: e totalt) av 1981 NFL-utkast av San Francisco 49ers. Nivån på skicklighet som demonstrerades av 6-fots, 203-Pund standout erkändes omedelbart, och från början av träningslägret hade han jobbet som 49ers start vänstra hörnback. Under sin rookiesäsong 1981 spelade han in sju avlyssningar, hjälpte 49ers att vinna Super Bowl XVI, och blev också bara den andra rookie i NFL-historien som återvände tre avlyssningar för touchdowns. Hans enastående spel resulterade i att han slutade andra för årets rookie utmärkelser, bakom New York Giants linebacker Lawrence Taylor.

Lott bytte till säkerhetspositionen 1985. Han hade spetsen på sitt vänstra rosa finger amputerat efter säsongen 1985 när den krossades medan han tacklade Timmy Newsome, och en bentransplantationskirurgi skulle inte ha tillåtit honom att starta säsongen 1986. En skada sidelined honom för säsongens två sista matcher 1986, men han ledde fortfarande ligan med en karriär-bästa 10 avlyssningar, medan han spelade in 77 tacklingar, tre tvingade fumlar och två quarterback säckar. Under sina 10 år med 49ers hjälpte Lott dem att vinna åtta divisionstitlar och fyra Super Bowls: XVI (säsongen 1981), XIX (1984), XXIII (1988) och XXIV (1989). Han är en av fem spelare som var på alla fyra 1980-talet 49ers Super Bowl vinner. De andra fyra är quarterback Joe Montana, linebacker Keena Turner, cornerback Eric Wrightoch bred mottagare Mike Wilson.efter sin karriär i San Francisco undertecknade Lott som fri agent 1991 med Los Angeles Raiders och 1993 med New York Jets. 1991 ledde han ligan i avlyssningar (8) för andra gången. Lott tecknade ett friagentavtal med Kansas City Chiefs 1995, men skadades under försäsongen. Han återvände till 49ers 1995, men de skador han hade lidit under de senaste fyra säsongerna fortsatte att plåga honom, och han meddelade sin pension innan säsongen började. Han valdes till Pro Football Hall of Fame 2000, hans första år av behörighet, och utsågs också till NFL: s 75-årsjubileumslag 1994 och 100-årsjubileumslaget 2019.

under sina 14 NFL-säsonger spelade Lott in 8,5 säckar och 63 avlyssningar, som han återvände för 730 yards och fem touchdowns. Han återhämtade 17 fumlar, returnerade dem för 43 yards och fick 113 yards på kickoff returns. Lott spelade också i 20 postsäsongsspel, spelade in nio avlyssningar, 89 tacklingar, en tvingad fumla, en fumla återhämtning och två touchdowns. Dessutom namngavs han All-Pro åtta gånger, All-NFC sex gånger och All-AFC en gång. Utöver statistiken hade Lott en otrolig medvetenhet om hur ett spel utvecklades, vilket gjorde det möjligt för honom att bryta upp pass och tjäna ett rykte som en av de svåraste och mest effektiva open-field-tacklarna i ligans historia.