metodologiska aspekter

Streptozotocin (2-deoxi-2-(3-metyl-3-nitrosoureido)-d-glucopyranose), ett antibiotikum med antineoplastiska effekter som produceras av Streptomyces achromogenes-bakterier, förstör selektivt bukspottkörtelcellerna i Langerhans öar (Fig. 9.1).11 Streptozotocin inducerar DNA-strängbrott och DNA-alkylering, vilket leder till nekros av bukspottskörtelceller.12,13 Streptozotocin transporteras in i cellen av glukostransportören GLUT2, och därför krävs expression av GLUT2 för den toxiska effekten.13,14 signalvägarna för den toxiska effekten av streptozotocin involverar aktivering av inducerbart NO-syntas, ökning av NO-koncentration,15 och ökad H2O2-generation.16

figur 9.1. Histologi och immunohistokemi av pankreatiska öar av Langerhans i kontroll (vänster panel) och streptozotocin-inducerad diabetiker (höger panel) råttor.

hos råttor med diabetes minskade antalet och storleken på öarna och immunoreaktiviteten för insulin minskade.

utveckling av diabetes mellitus efter applicering av streptozotocin är mycket snabb, särskilt hos råtta. Känsligheten hos cellerna i cellern till glukos reduceras redan signifikant 2 timmar efter applicering av streptozotocin; förstörelsen och signifikant minskning av antalet celler i cellern sker inom några timmar efter applicering.17 Detta åtföljs av förändringar i glukos-och insulinplasmanivåerna: 2 timmar efter applicering utvecklas en hyperglykemi utan förändringar i plasma-och bukspottkörtelns insulinnivåer, följt av hypoglykemi med ökade plasmanivåer av insulin men ingen förändring i pankreatisk insulinnivå. En dag efter applicering av streptozotocin visar råttorna alla karakteristiska symtom på diabetes, inklusive hyperglykemi, glykosuri, polyuri och reducerade plasma-och pankreasinsulinnivåer.18

Streptozotocin kan appliceras i en enda dos eller på ett upprepat sätt, vanligtvis upplöst i citratbuffert (pH 4.5), genom intravenös, intraperitoneal eller intra-arteriell injektion. I våra experiment inducerades diabetes på ett tillförlitligt sätt genom en enda intravenös injektion av streptozotocin upplöst i citratbuffert i svansvenen, i en dos av 65 mg/kg kroppsvikt. Den dos som krävs för diabetesinduktion hos råttor varierar mellan 40 och 60 mg/kg kroppsvikt, även om högre värden ibland rapporteras.19 de diabetiska symtomen korrelerar väl med den använda dosen. I allmänhet observeras vid doser under 40 mg/kg kroppsvikt endast små förändringar i glykemi, glykosuri och insulinplasmanivåer, och dessa små förändringar tenderar att normalisera spontant hos upp till 25% av djuren.18 med en tillräcklig dos streptozotocin är induktionen av diabetes hos råttor lätt, snabb och pålitlig. I de flesta studier som använder denna råttmodell har emellertid patogenesen av diabetes och associerade symtom studerats endast i flera veckor eller månader, under vilka diabetes är fullt utvecklad och underhållen. De långsiktiga effekterna av streptozotocin och möjlig återhämtning från streptozotocin-inducerad diabetes har undersökts mycket mindre.

i våra experiment följde vi råttor med streptozotocin-inducerad diabetes i 1 år, och återhämtning observerades hos en betydande andel djur. Alla 152 råttor visade fullblåst diabetes under de första 6 månaderna av experimentet; under andra halvåret kunde två olika grupper tydligt särskiljas. I diabetesgruppen (n = 92) förblev glykemi hög (> 18 mmol/L), kroppsvikt ökade inte, plasmanivåerna av insulin hölls låga och histologisk analys avslöjade minskning av antalet och storleken på pankreatiska öar, med brist på insulinutsöndrande celler. Däremot visade återhämtningsgruppen (n = 60) signifikanta skillnader under andra halvåret, som inte hade varit närvarande under de första 6 månaderna av experimentet: lägre glykemi (< 12 mmol/L), stadigt ökande kroppsvikt och högre plasmanivåer av insulin, vilket närmade sig värden som hittades hos kontrolldjur. Den histologiska strukturen hos bukspottskörtelöarna liknade också den hos kontrolldjur,med ett antal välbevarade cellerna i bukspottkörteln. Därför, efter 6 månader fanns det en betydande grupp av djur (40% i 20%) som visade en signifikant återhämtning, med ett antal parametrar som närmar sig värden som ses i kontroll, icke-diabetiska djur. Det enda testet som på ett tillförlitligt sätt kunde skilja återhämtningsdjuren från icke-diabetiska kontroller var glukostoleransprovet. Glukostoleransprovet utfördes under experimentets 9: e och 12: e månader, och kurvan för återhämtningsdjuren visade tydligt patologiska värden som liknar diabetesgruppen och signifikant skiljer sig från de hos kontroll-icke-diabetiska djur. Båda streptozotocingrupperna svarade med en minskad utsöndring av insulin. Sammanfattningsvis var streptozotocin-inducerad diabetes mellitus hos råttor stabil i 6 månader; därefter utvecklades emellertid en betydande återhämtning i 40% av djuren i 20% av befolkningen. Den funktionella insufficiensen av återhämtningen under denna period (7-12 månader efter applicering av streptozotocin) kan avslöjas genom glukostoleransprovet. Insulinsekretionen hos återvinningsdjur är förmodligen tillräcklig i vila; en ökad glukosbelastning avslöjar emellertid den fortfarande försämrade glukostoleransen. Hos majoriteten av djuren (60% av djuren) observerades ingen återhämtning och svår diabetes kvarstod under 12 månader. En spontan återhämtning från streptozotocin-inducerad diabetes har redan beskrivits hos nyfödda råttor,där streptozotocin applicerades vid födseln, 20 och hos vuxna djur, men med låg dos streptozotocin.21,22

Streptozotocin används också för induktion av diabetes hos andra arter, förutom råttan. Hos möss kan typ i-diabetes induceras antingen genom en enda högre dos streptozotocin eller genom upprepad applicering av lägre doser, båda applicerade intraperitonealt. Vid engångsapplikation beskrivs en tillförlitlig induktion för doser på 200 mg/kg.23,24 en allvarlig nackdel med engångsapplikation är den mycket höga omedelbara dödligheten (upp till 90% för 180 mg/kg i våra händer). Upprepad applicering av streptozotocin utförs vanligtvis med doser på 40-50 mg / kg dagligen applicerade i 5 på varandra följande dagar.25 de karakteristiska diabetiska symtomen (hyperglykemi, glykosuri, stillastående kroppsvikt) utvecklas efter applicering av den sista dosen. Mössen visar vanligtvis signifikanta skillnader mellan könen: hos hanmöss var plasmanivåerna av glukos efter applicering av streptozotocin signifikant högre än hos honmöss. Eftersom testosteronadministrering är känd för att öka det hyperglykemiska svaret hos kastrerade män och kvinnor såväl som hos icke-kastrerade kvinnor, bidrar det förmodligen till de diabetogena effekterna av streptozotocin.26

resultat i marsvinet är kontroversiella. Enligt vissa studier är marsvin resistenta mot de diabetogena effekterna av streptozotocin.27 däremot beskriver andra studier en pålitlig marsvinmodell av streptozotocin-inducerad diabetes, på grundval av minskad tillväxthastighet, dysfunktion i cellerna i cellerna, polydipsi, polyuri och glykosuri.28 skillnader i de experimentella metoderna för diabetesinduktion, särskilt dosering och applicering, kan vara ansvariga för dessa skillnader. De mest rekommenderade metoderna innefattar intrakardiell applicering av streptozotocin (200 mg/kg) föregås av insulinadministration,29 intrakardiell injektion av streptozotocin (150 mg/kg) utan insulin,28 eller intravenös applicering av streptozotocin.30 baserat på skillnader i metoden för diabetesinduktion skiljer sig diabetesparametrarna, sjukdomsförloppet och tillhörande dödlighet också mellan modellerna. Under våra experimentella förhållanden, medan den intraperitoneala appliceringen av streptozotocin (300 mg/kg) inte inducerade några diabetiska symtom, ledde intravenös administrering av streptozotocin (150 mg/kg) till signifikant glykosuri. Histologisk analys av bukspottkörteln avslöjade inga tecken på förstörelse av öar, oavsett metod för administrering av streptozotocin. Även den glykosuri som observerats efter intravenös administrering av streptozotocin kan inte vara det diabetiska symptomet, utan snarare ett resultat av en direkt nefrotoxisk effekt av streptozotocin, som har beskrivits hos patienter. Denna hypotes stöds av det faktum att en daglig administrering av insulin (5 IE/kg) inte hindrade glykosuri.

När det gäller kaninmodellen för diabetes råder studier med alloxaninducerad modell tydligt. Studier med streptozotocin-inducerad diabetes hos kaninen är sällsynta och motsägelsefulla. Det finns vissa tecken på diabetogena effekter av streptozotocin hos vuxna kaniner såväl som foster, men andra studier argumenterar mot denna möjlighet.27,31-34

hos stora däggdjur har streptozotocin framgångsrikt använts för att inducera diabetes hos hunden och grisen. Hos hunden var appliceringen av streptozotocin associerad med hög dödlighet och därför har flera tekniker utvecklats för att minska dosen av streptozotocin och tillhörande dödlighet. Freyse et al.35 kombinerad partiell pankreatektomi och lågdos (2 mg/kg) streptozotocininfusion i den överlägsna pankreatikoduodenala artären. Andra tekniker inkluderar en kombinerad intravenös administrering av streptozotocin och alloxan, och suprarenal intra-arteriell infusion av streptozotocin och alloxan efter ballongocklusion av den juxtarenala abdominal aorta.36,37 en annan stor däggdjursarter som är känsliga för de diabetogena effekterna av streptozotocin är grisen (och minipig). För en tillförlitlig diabetogen effekt av streptozotocin hos både gris och minipig behövs en dos på 100-150 mg/kg.38 hos minipigs har en framgångsrik induktion av diabetes med två låga doser (40 mg/kg) också rapporterats.39