Aptamers har dykt upp som en ny kategori inom bioreceptorer på grund av deras breda tillämpningar som sträcker sig från biosensing till terapi. Flera variationer av deras screeningprocess, kallad SELEX, har rapporterats som kan ge sekvenser med önskade egenskaper som behövs för deras slutliga användning.

generering av enkelsträngad oligonukleotidbibliotekedit

SELEX första steg innefattar syntes av helt eller delvis randomiserade oligonukleotidsekvenser av viss längd flankerad av definierade regioner som tillåter PCR-amplifiering av de randomiserade regionerna och, i fallet med RNA SELEX, in vitro transkription av den randomiserade sekvensen. Medan Ellington och Szostak visade att kemisk syntes kan generera ~1015 unika sekvenser för oligonukleotidbibliotek i deras 1990-papper om in vitro-urval, fann de att amplifiering av dessa syntetiserade oligonukleotider ledde till betydande förlust av pooldiversitet på grund av PCR-bias och defekter i syntetiserade fragment. Oligonukleotidpoolen förstärks och en tillräcklig mängd av det ursprungliga biblioteket läggs till reaktionen så att det finns många kopior av varje enskild sekvens för att minimera förlusten av potentiella bindningssekvenser på grund av stokastiska händelser. Innan biblioteket introduceras för mål för inkubation och selektiv retention måste sekvensbiblioteket konverteras till enkelsträngade oligonukleotider för att uppnå strukturella konformationer med målbindningsegenskaper.

target incubationEdit

omedelbart före målintroduktionen värms det enkelsträngade oligonukleotidbiblioteket ofta upp och kyls långsamt för att renaturera oligonukleotider till termodynamiskt stabila sekundära och tertiära strukturer. En gång förberedd inkuberas det randomiserade biblioteket med immobiliserat mål för att tillåta oligonukleotid-målbindning. Det finns flera överväganden för detta målinkubationssteg, inklusive målimmobiliseringsmetoden och strategier för efterföljande obunden oligonukleotidseparation, inkubationstid och temperatur, inkubationsbuffertbetingelser och mål kontra oligonukleotidkoncentrationer. Exempel på målimmobiliseringsmetoder inkluderar affinitetskromatografikolumner, nitrocellulosbindningsanalysfilter och paramagnetiska pärlor. Nyligen har SELEX-reaktioner utvecklats där målet är hela celler, som expanderas nära fullständig sammanflöde och inkuberas med oligonukleotidbiblioteket på odlingsplattor. Inkubationsbuffertbetingelser ändras baserat på det avsedda målet och önskad funktion hos den valda aptameren. Till exempel, i fallet med negativt laddade små molekyler och proteiner, används höga saltbuffertar för laddningsscreening för att tillåta nukleotider att närma sig målet och öka risken för en specifik bindningshändelse. Alternativt, om den önskade aptamerfunktionen är in vivo-protein eller helcellsbindning för potentiell terapeutisk eller diagnostisk applikation, inkubationsbuffertbetingelser som liknar in vivo plasmasaltkoncentrationer och homeostatiska temperaturer är mer benägna att generera aptamerer som kan binda in vivo. Ett annat övervägande i inkubationsbuffertförhållanden är icke-specifika konkurrenter. Om det finns en hög sannolikhet för icke-specifik oligonukleotidretention under reaktionsbetingelserna, kan icke-specifika konkurrenter, som är små molekyler eller polymerer andra än SELEX-biblioteket som har liknande fysikaliska egenskaper som bibliotekets oligonukleotider, användas för att uppta dessa icke-specifika bindningsställen. Att variera den relativa koncentrationen av mål-och oligonukleotider kan också påverka egenskaperna hos de valda aptamererna. Om en bra bindningsaffinitet för den valda aptameren inte är ett problem, kan ett överskott av mål användas för att öka sannolikheten för att åtminstone vissa sekvenser kommer att binda under inkubation och behållas. Detta ger emellertid inget selektivt tryck för hög bindningsaffinitet, vilket kräver att oligonukleotidbiblioteket överstiger så att det finns konkurrens mellan unika sekvenser för tillgängliga specifika bindningsställen.

bindande sekvenselution och amplificationEdit

När oligonukleotidbiblioteket har inkuberats med target under tillräcklig tid tvättas obundna oligonukleotider bort från immobiliserat target, ofta med användning av inkubationsbufferten så att specifikt bundna oligonukleotider behålls. Med obundna sekvenser tvättas bort, de specifikt bundna sekvenserna elueras sedan genom att skapa denatureringsbetingelser som främjar oligonukleotid utvecklas eller förlust av bindande konformation inklusive strömmar i avjoniserat vatten, med användning av denatureringslösningar innehållande urea och EDTA, eller genom att applicera hög värme och fysisk kraft. Vid eluering av bundna sekvenser transkriberas de kvarhållna oligonukleotiderna till DNA i fallet med RNA eller modifierade basval, eller samlas helt enkelt för amplifiering i fallet med DNA SELEX. Dessa DNA-mallar från eluerade sekvenser förstärks sedan via PCR och omvandlas till enkelsträngat DNA, RNA eller modifierade basoligonukleotider, som används som initial ingång för nästa omgång av urval.

erhålla ssDNAEdit

ett av de mest kritiska stegen i SELEX-proceduren är att erhålla enkelsträngat DNA (ssDNA) efter PCR-förstärkningssteget. Detta kommer att fungera som input för nästa cykel så det är av avgörande betydelse att allt DNA är enkelsträngat och så lite som möjligt går förlorat. På grund av den relativa enkelheten använder en av de mest använda metoderna biotinylerade omvända primers i förstärkningssteget, varefter de komplementära strängarna kan bindas till ett harts följt av eluering av den andra strängen med lut. En annan metod är asymmetrisk PCR, där förstärkningssteget utförs med ett överskott av framåtprimer och mycket liten omvänd primer, vilket leder till produktion av mer av den önskade strängen. En nackdel med denna metod är att produkten bör renas från dubbelsträngat DNA (dsDNA) och annat kvarvarande material från PCR-reaktionen. Enzymatisk nedbrytning av den oönskade strängen kan utföras genom att märka denna sträng med användning av en fosfatprobed primer, eftersom den känns igen av enzymer såsom Lambda-exonukleas. Dessa enzymer bryter sedan selektivt ned den fosfatmärkta strängen och lämnar den komplementära strängen intakt. Alla dessa metoder återvinner cirka 50 till 70% av DNA. För en detaljerad jämförelse hänvisas till artikeln av Svobodov Avsugningar et al. där dessa och andra metoder jämförs experimentellt. I klassisk SELEX, processen för randomiserad enkelsträngad biblioteksgenerering, målinkubation, och bindande sekvenselution och amplifiering som beskrivs ovan upprepas tills den stora majoriteten av den kvarhållna poolen består av målbindningssekvenser, även om det finns modifieringar och tillägg till proceduren som ofta används, vilka diskuteras nedan.

negativ eller motvalredigera

för att öka specificiteten hos aptamerer som valts med ett givet SELEX-förfarande kan ett negativt urval eller motval läggas till före eller omedelbart efter målinkubation. För att eliminera sekvenser med affinitet för mål-immobiliseringsmatriskomponenter från poolen kan negativt urval användas där biblioteket inkuberas med mål-immobiliseringsmatriskomponenter och obundna sekvenser behålls. Negativt urval kan också användas för att eliminera sekvenser som binder målliknande molekyler eller celler genom att inkubera oligonukleotidbiblioteket med små molekylmålanaloger, oönskade celltyper eller icke-målproteiner och behålla de obundna sekvenserna.

spårningsval progressionEdit

för att spåra utvecklingen av en SELEX-reaktion kan antalet målbundna molekyler, vilket motsvarar antalet eluerade oligonukleotider, jämföras med den uppskattade totala inmatningen av oligonukleotider efter eluering vid varje omgång. Antalet eluerade oligonukleotider kan uppskattas genom elueringskoncentration uppskattningar via 260 nm våglängdsabsorbans eller fluorescerande märkning av oligonukleotider. När SELEX-reaktionen närmar sig slutförandet närmar sig fraktionen av oligonukleotidbiblioteket som binder målet 100%, så att antalet eluerade molekyler närmar sig den totala oligonukleotidinmatningsuppskattningen, men kan konvergera vid ett lägre antal.

varningar och överväganderedigera

vissa SELEX-reaktioner kan generera sonder som är beroende av primerbindningsregioner för sekundär strukturbildning. Det finns aptamer applikationer för vilka en kort sekvens, och därmed primer trunkering, är önskvärd. Ett framsteg på den ursprungliga metoden tillåter ett RNA-bibliotek att utelämna de konstanta primerregionerna, vilket kan vara svårt att ta bort efter urvalsprocessen eftersom de stabiliserar sekundära strukturer som är instabila när de bildas av den slumpmässiga regionen ensam.