Aptamers zijn naar voren gekomen als een nieuwe categorie op het gebied van bioreceptoren vanwege hun brede toepassingen variërend van biosensering tot therapeutica. Verscheidene variaties van hun onderzoeksproces, genoemd SELEX zijn gemeld die opeenvolgingen met gewenste eigenschappen kunnen opleveren die voor hun definitief gebruik worden vereist.

het genereren van single stranded oligonucleotide libraryEdit

de eerste stap van SELEX omvat de synthese van volledig of gedeeltelijk gerandomiseerde oligonucleotidesequenties van enige lengte geflankeerd door gedefinieerde gebieden die PCR-versterking van die gerandomiseerde gebieden mogelijk maken en, in het geval van RNA SELEX, in vitro transcriptie van de gerandomiseerde sequentie. Terwijl Ellington en Szostak aantoonden dat de chemische synthese ~1015 unieke opeenvolgingen voor oligonucleotidebibliotheken in hun document van 1990 over selectie in vitro kan produceren, vonden zij dat de versterking van deze gesynthetiseerde oligonucleotides tot significant verlies van pooldiversiteit toe te schrijven aan PCR bias en tekorten in gesynthetiseerde fragmenten leidde. De oligonucleotidepool wordt vergroot en een voldoende hoeveelheid van de aanvankelijke bibliotheek wordt aan de reactie toegevoegd zodat er talrijke exemplaren van elke individuele opeenvolging zijn om het verlies van potentiële bindende opeenvolgingen toe te schrijven aan stochastische gebeurtenissen te minimaliseren. Alvorens de bibliotheek aan doel voor incubatie en selectief behoud wordt geà ntroduceerd, moet de opeenvolgingsbibliotheek in enige vastgelopen oligonucleotides worden omgezet om structurele conformations met doelbindende eigenschappen te bereiken.

Target incubationEdit

vlak voor de introductie van target wordt de single stranded oligonucleotide library vaak verhit en langzaam gekoeld om oligonucleotiden te renatureren tot thermodynamisch stabiele secundaire en tertiaire structuren. Eenmaal voorbereid, wordt de gerandomiseerde bibliotheek geïncubeerd met geà mmobiliseerd doel om oligonucleotide-doelbinding toe te staan. Er zijn verscheidene overwegingen voor deze stap van de doelincubatie, met inbegrip van de methode van de doelimmobilisatie en strategieën voor verdere ongebonden oligonucleotidescheiding, incubatietijd en temperatuur, incubatiebuffervoorwaarden, en doel versus oligonucleotideconcentraties. De voorbeelden van methodes van doelimmobilisatie omvatten de kolommen van de affiniteitschromatografie, de filters van de nitrocellulose bindende analyse, en paramagnetische parels. Onlangs, zijn de reacties van SELEX ontwikkeld waar het doel gehele cellen is, die dichtbij volledige samenvloeiing worden uitgebreid en met de oligonucleotidebibliotheek op cultuurplaten worden uitgebroed. De omstandigheden van de incubatiebuffer worden gewijzigd op basis van het beoogde doel en de gewenste functie van de geselecteerde aptamer. Bijvoorbeeld, in het geval van negatief geladen kleine molecules en proteã nen, worden de hoge zoute buffers gebruikt voor ladingsonderzoek om nucleotiden toe te staan om het doel te benaderen en de kans van een specifieke bindende gebeurtenis te verhogen. Als de gewenste aptameerfunctie in vivo eiwit-of gehele celbinding is voor potentiële therapeutische of diagnostische toepassing, zullen incubatiebufferomstandigheden vergelijkbaar met in vivo plasmaconcentraties van plasmazut en homeostatische temperaturen eerder aptamers genereren die in vivo kunnen binden. Een andere overweging in incubatiebufferomstandigheden zijn niet-specifieke concurrenten. Als er een hoge waarschijnlijkheid van niet-specifiek oligonucleotidebehoud in de reactievoorwaarden is, kunnen niet specifieke concurrenten, die kleine molecules of polymeren buiten de selexbibliotheek zijn die gelijkaardige fysische eigenschappen aan de bibliotheekoligonucleotides hebben, worden gebruikt om deze niet-specifieke bindingsplaatsen te bezetten. Het variëren van de relatieve concentratie van doel en oligonucleotides kan Eigenschappen van de geselecteerde aptamers ook beà nvloeden. Als een goede bindende affiniteit voor geselecteerde aptamer geen zorg is, dan kan een overmaat van doel worden gebruikt om de waarschijnlijkheid te verhogen dat minstens sommige opeenvolgingen tijdens incubatie zullen binden en worden behouden. Nochtans, verstrekt dit geen selectieve druk voor hoge bindende affiniteit, die de oligonucleotidebibliotheek vereist om in overmaat te zijn zodat er concurrentie tussen unieke opeenvolgingen voor beschikbare specifieke bandplaatsen is.

Binding sequence elution and amplificationEdit

zodra de oligonucleotidebibliotheek gedurende voldoende tijd is geïncubeerd met target, worden ongebonden oligonucleotiden weggespoeld van geïmmobiliseerde target, vaak met behulp van de incubatiebuffer, zodat specifiek gebonden oligonucleotiden worden behouden. Met ongebonden opeenvolgingen weggespoeld, worden de specifiek gebonden opeenvolgingen dan geëlueerd door denatureringsvoorwaarden te creëren die oligonucleotide het ontvouwen of verlies van bindende Bouw bevorderen met inbegrip van het stromen in gedeïoniseerd water, gebruikend denatureringsoplossingen die ureum en EDTA bevatten, of door hoge hitte en fysieke kracht toe te passen. Op elution van verbindende opeenvolgingen, worden de bewaarde oligonucleotides omgekeerd-getranscribeerd aan DNA in het geval van RNA of gewijzigde basisselecties, of eenvoudig voor versterking in het geval van DNA-Selex verzameld. Deze malplaatjes van DNA van eluted opeenvolgingen worden dan vergroot via PCR en omgezet in enige vastgelopen DNA, RNA, of gewijzigde basis oligonucleotides, die als aanvankelijke input voor de volgende ronde van selectie worden gebruikt.

het verkrijgen van ssDNAEdit

een van de meest kritische stappen in de Selex-procedure is het verkrijgen van single stranded DNA (ssDNA) na de PCR-amplificatiestap. Dit zal als input voor de volgende cyclus dienen zodat is het van vitaal belang dat al DNA enkel vastgelopen is en zo weinig mogelijk verloren gaat. Wegens de relatieve eenvoud, is één van de meest gebruikte methodes gebruikend biotinylated omgekeerde inleidingen in de versterkingsstap, waarna de complementaire bundels aan een hars kunnen worden gebonden die door elution van de andere bundel met loog wordt gevolgd. Een andere methode is asymmetrische PCR, waar de versterkingsstap met een overmaat van voorwaartse inleiding en zeer weinig omgekeerde inleiding wordt uitgevoerd, die tot de productie van meer van de gewenste bundel leidt. Een nadeel van deze methode is dat het product van dubbel vastgelopen DNA (dsDNA) en ander restmateriaal van de PCR-reactie zou moeten worden gezuiverd. De enzymatische degradatie van de ongewenste bundel kan worden uitgevoerd door deze bundel te merken gebruikend een fosfaat-gesonde inleiding, aangezien het door enzymen zoals Lambda exonuclease wordt erkend. Deze enzymen degraderen dan selectief het fosfaat geëtiketteerde bundel het verlaten van de complementaire bundel intact. Al deze methodes herstellen ongeveer 50 tot 70% van DNA. Voor een gedetailleerde vergelijking verwijzen we naar het artikel van Svobodová et al. waar deze en andere methoden experimenteel worden vergeleken. In klassieke SELEX, worden het proces van gerandomiseerde enige vastgelopen bibliotheekgeneratie, doelincubatie, en bindende opeenvolgingselution en versterking hierboven beschreven herhaald tot de overgrote meerderheid van de behouden pool uit doel bindende opeenvolgingen bestaat, hoewel er wijzigingen en toevoegingen aan de procedure zijn die vaak worden gebruikt, die hieronder worden besproken.

negatieve of teller selectiedit

om de specificiteit van aptamers geselecteerd door een bepaalde Selex procedure, een negatieve selectie, of teller selectie, stap kan worden toegevoegd vóór of onmiddellijk na doel incubatie. Om opeenvolgingen met affiniteit voor de matrijscomponenten van de doelimmobilisatie uit de pool te elimineren, kan de negatieve selectie worden gebruikt waar de bibliotheek met de matrijscomponenten van de doelimmobilisatie wordt geïncubeerd en de ongebonden opeenvolgingen worden behouden. De negatieve selectie kan ook worden gebruikt om opeenvolgingen te elimineren die doel-als molecules of cellen binden door de oligonucleotidebibliotheek met de kleine analogen van het molecuuldoel, ongewenste celtypes, of niet-doelproteã nen te incuberen en de ongebonden opeenvolgingen te behouden.

Tracking selection progressionEdit

om de voortgang van een Selex-reactie te volgen, kan het aantal doelgebonden moleculen, dat gelijk is aan het aantal geëlueerde oligonucleotiden, worden vergeleken met de geschatte totale input van oligonucleotiden na elutie bij elke ronde. Het aantal eluted oligonucleotides kan door schattingen van de elutieconcentratie via golflengteabsorbantie van 260 nm of fluorescente etikettering van oligonucleotides worden geschat. Aangezien de reactie van SELEX voltooiing nadert, benadert de fractie van de oligonucleotidebibliotheek die doel bindt 100%, zodanig dat het aantal geëlueerde molecules de totale schatting van de oligonucleotideinput benadert, maar bij een lager aantal kan convergeren.

kanttekeningen en beschouwingendit

sommige selexreacties kunnen sondes genereren die afhankelijk zijn van primerbindingsgebieden voor secundaire structuurvorming. Er zijn aptamer toepassingen waarvoor een korte sequentie, en dus primer afkappen, wenselijk is. Een vooruitgang op de originele methode staat een bibliotheek van RNA toe om de constante inleidingsgebieden weg te laten, die moeilijk kunnen zijn om na het selectieproces te verwijderen omdat zij secundaire structuren stabiliseren die onstabiel zijn wanneer gevormd door het willekeurige gebied alleen.