TR-1003-G Sigma-AldrichPolybrene infectie/transfectie reagens
een zeer efficiënte methode voor genoverdracht naar zoogdiercel is door infectie met retrovirale vectoren. De efficiëntie van retrovirale infectie wordt significant verhoogd, 100 tot 1.000 vouwen in sommige cellen, door polybrene tijdens de infectie op te nemen. Polybrene met een DMSO-schok wordt ook gebruikt om de overdracht van DNA in een verscheidenheid van celtypes, zoals CHO, fibroblasten van het kippenembryo, NINH-3T3 en Myeloid cellen te bemiddelen.
Protocol: Retrovirale infectie
Recombinant retrovirale voorraden worden bereid door 5 ml groeimedium met 5% serum toe te voegen aan een bijna samenvloeiende monolaag van transfecte retrovirale verpakkingscellen in een plaat van 100 mm. Na 24 uur wordt het medium verwijderd en gefilterd door een 0.45 um filter.
cellen die geïnfecteerd zijn met deze recombinant retrovirale voorraad worden bedekt met 500.000 cellen per plaat van 100 mm in 10 ml volledig medium. 24 uur later, verwijder het groeimedium uit de cellen. Infecteer cellen met 2mls van het virale supernatant (of een verdunning van de virusvoorraad in 2mls) in aanwezigheid van 5ug tot 10ug polybrene per ml (eindconcentratie). Incubeer de cellen gedurende 3 tot 6 uur bij 37°C. voeg 8 ml volledig medium toe. Drie dagen na infectie, splits de cellen 1: 5 in selectiemedium. Toyoshima, K. and Vogt, P. K., 1969. Virologie. 38: 414-426 Coelen, J. R., Jose, D. G. en May, J. T. 1983. Boog. Virol. 75: 307-311
Protocol: transfectie
Plaatcellen bij ongeveer 50% samenvloeiing in volledig groeimedium.
18 tot 24 uur na het plateren bereid de DNA-Medium-Polybreenoplossing onmiddellijk voor gebruik als volgt:
opmerking: elk bestanddeel moet in de juiste volgorde worden toegevoegd.
1st: volledig groeimedium (2mls voor een plaat van 60 mm en 3mls voor een plaat van 100 mm) opgewarmd tot 37°C.
2nd: plasmide DNA, 10ng tot 10ug. Meng voorzichtig.
3e: Polybrene tot een eindconcentratie van 5ug tot 10ug per ml. Meng
verwijder medium van de plaat en voeg DNA-Medium-Polybreenoplossing toe aan cellen. Incubeer de cellen bij 37°C gedurende 6 tot 20 uur en af en toe voorzichtig schommelen ongeveer om de 1 uur.5 uur voor de eerste 6 uur. verwijder DNA-Medium-Polybrene oplossing en bedek cellen voorzichtig met DMSO shock oplossing (15% DMSO in 1X HBSS: Specialty Media catalog #S-051-D) 3 ml per 60mm schotel en 4 ml per 100mm plaat. Schud de schaal gedurende 10 Seconden handmatig om de oplossing gelijkmatig te verdelen en incubeer de cellen gedurende precies 4 minuten bij 37°C.
verwijder onmiddellijk de DMSO shock-oplossing en spoel de cellen voorzichtig tweemaal met volledig groeimedium, 5mls per wasbeurt per 60 mm schaal, 10mls per wasbeurt per 100 mm schaal
voeg volledig groeimedium toe aan de cellen.
voor stabiele transformanten, verwijder de groeimedia en splits de cellen 1:5 in selectiemedium.
voor voorbijgaande expressie, verwijder het groeimedium en voeg vers groeimedium toe. Oogst cellen en / of medium na 24 tot 72 uur. Chaney, W. G. et al., 1986. Somatische cel en Moleculaire Genetica. Vol. 12, Nr. 23,
237-244. Aubin, R. J. et al. 1988. Somatische cel en Moleculaire Genetica. Vol. 14, Nr. 2, 155-167. Chisholm, O. et al., 1998. Onderzoek Naar Nucleïnezuren. Vol. 16, Nr. 5, 2352
reagens wordt gefilterd door 0,2 um membranen en gehydrateerd met steriel H20.