Extracelulární matrix příprava a reologie

modul ECM se skládá ze sítě želatiny a fibrinu. Chcete-li připravit ECM komponent, 15 wt/v% roztokem želatiny (Typ A, 300 bloom z prasečí kůže, Sigma) je první získaný přidáním želatiny prášek do teplého roztoku (70 °C) DPBS (1X Dulbelco je fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku bez kalcia a hořčíku). Želatina se nechá úplně rozpustit mícháním po dobu 12 h při 70 °C a pH se potom upraví na 7,5 za použití 1 M NaOH. Roztok je sterilní filtruje a uloženy při 4 °C v alikvotních pro pozdější použití při odlévání (<3 měsíce). Roztok fibrinogenu (50 mg / mL) se vyrábí rozpuštěním lyofilizovaného proteinu bovinní krevní plazmy (Millipore) při 37 °C ve sterilních DPB bez vápníku a hořčíku. Roztok se udržuje při 37 °C bez míchání po dobu nejméně 45 minut, aby se umožnilo úplné rozpuštění. Na transglutaminase (TG) roztoku (60 mg/mL) se připraví rozpuštěním lyofilizovaného prášku (Moo Gloo) v DPBS bez vápníku a hořčíku a jemně míchání po dobu 20 sec. Řešení je pak držel na 37 °C po dobu 20 min a sterilní filtruje před použitím. Zásobní roztok CaCl2 (250 mM) se připraví rozpuštěním prášku CaCl2 v DPBS bez vápníku a hořčíku (Corning). Pro přípravu zásobního roztoku trombinu, lyofilizované trombinu (Sigma Aldrich) rozpuštěného v 500 Iu/mL pomocí sterilního DPBS a skladovány při -20 °C. Trombin alikvoty jsou rozmrazení bezprostředně před použitím.

kontrolované napětí rheometer (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) s průměrem 40 mm, 2° kužel a deska geometrie se používá pro inkoustové reologie měření. Moduly smykového úložiště (G‘) a ztrát (G“) se měří při frekvenci 1 Hz a oscilačním kmeni (γ) 0,01. Čas zamete jsou prováděny rychle, umístění namíchané ECM řešení, které obsahuje trombin na Peltier plate držel na 37 °C.

Inkoust přípravky

Dva inkousty jsou potřebné pro 3D bioprinting z perfusable PT modelů. Jeden inkoust, který se používá k vytvoření perfuze čip těsnění, se skládá ze dvou částí silikonový elastomer (SE 1700, DOW Chemical) s 10:1 základnu, aby katalyzátor (podle hmotnosti), které je homogenizované pomocí odstředivé mixéru po dobu 2 min (2000 ot / min, AE-310, Přemýšlivý Corp., Japonsko). Silikonový inkoust se tiskne do 2 h od smíchání s katalyzátorem. Tento inkoust je vložen do injekční stříkačky (EFD Inc., East Providence, RI) a odstředí se, aby se odstranily vzduchové bubliny před tiskem při pokojové teplotě. Druhý inkoust, fugitivní inkoust používaný k tisku tubulu, se skládá z 38% hmotnostních Pluronic F127 (Sigma) a 100 U/mL trombinu v deionizované, ultrafiltrované (DIUF) vodě. Fugitivní inkoust je barven růžově přidáním barviva rizikového reaktoru pro vizualizaci na obr. 1 a film S1. Připravit tento inkoust, 40 wt% Pluronic F127 roztok ve vodě je homogenizované pomocí Přemýšlivý mixéru, dokud se prášek zcela nerozpustí, a následně skladovány při 4 °C. Před použitím, 2000 U/mL trombinu roztoku se přidá k útěku (Pluronic) inkoust v poměru 1:20, a homogenizované pomocí Přemýšlivý mixer. Uprchlý inkoust je pak vložen do injekční stříkačky (EFD Inc., East Providence, RI) při 4 °C a odstředí se, aby se odstranily vzduchové bubliny. Před tiskem se tento inkoust vyrovnává při pokojové teplotě po dobu nejméně 15 minut.

Bioprinting z perfusable 3D proximálního tubulu konstrukty

3D PT konstrukty jsou vyrobeny s použitím vlastní-navrženy tak, multimaterial 3D bioprinter vybaveny čtyři samostatně adresovatelné tiskové hlavy namontované na 3-osy, motion-řízené portálové s build objem 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech, Inc., Pittsburgh, PA USA). Inkousty jsou uloženy v samostatných sudech stříkaček, ke kterým jsou trysky různé velikosti (tj. průměr 50 µm–410 µm) připevněny pomocí luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Inkousty jsou vytlačovány přes depoziční trysky působením tlaku vzduchu (800 Ultra dávkovací systém, EFD Inc. East Providence, RI, USA), v rozmezí od 10-90 psi, odpovídající rychlost tisku mezi 1 mm/s a 5 cm/s. Jsme první tiskovou vlastní perfuze čip těsnění uložením silikonové inkoust přes kuželovou 410 µm tryska na 50 mm × 75 mm sklíčka. Návrh těsnění je vytvořen pomocí vlastního skriptu MATLAB, který generuje G-kód pro konečnou strukturu těsnění. Po tisku se těsnění perfuzního čipu vytvrdí při 80 °C v peci po dobu >1 h a před použitím se uchovává při pokojové teplotě.

vzorování 3D PTs v perfuzním čipu vyžaduje kombinaci lití ECM a tisku fugitivního inkoustu. Nejprve se roztok ECM vytvoří kombinací 10 mg/mL fibrinogenu, 7,5% hmotnostních želatiny, 2,5 mM CaCl2 a 0,2% hmotnostních TG. Tento roztok se pak před použitím vyrovná při 37 °C po dobu 15-20 minut, aby se zlepšila optická čistota ECM25. Dále se roztok rychle smísí s trombinem v poměru 500: 1, což vede k konečné koncentraci trombinu 1 U / ml. Během 2 minut při 37 °C následuje polymerace fibrinogenu na fibrinový gel. Z tohoto důvodu musí být roztok ECM odlit na základnu perfuzního čipu ihned po smíchání s trombinem. Základní vrstva ECM se pak nechá mírně zaschnout pod dusíkem, takže vytvoří rovný povrch. Uprchlík Pluronic F127 inkoust (100 U/mL trombinu) je vytištěno na základnu ECM vrstva v podobě spletité filmament (tubulus) pomocí kuželové 200 µm trysky. Vlastní Python skript (MeCode) se používá k určení dráhy nástrojů v G-kódu. Bezprostředně po útěku tisk inkoust, kovových dutých perfuze piny připojeny přes silikonové těsnění jsou uvedeny do kontaktu s vytištěného inkoustu. Vrchní vrstvou ECM je pak tvořen casting ECM řešení, přes tištěné kanálek, jak je popsáno výše, během 1-2 mm výška těsnění stěny. Pokud jsou buňky, například HNDFs, začleněny do ECM (obr. S5), jsou smíchány přímo po rovnovážném období, před mícháním trombinu a následným odléváním. Po horní ECM vrstva je obsazení, konstrukce je pokryta sklíčko, aby se zabránilo odpařování nebo znečištění a je držen na 37 °C za 1 h, aby polymerace fibrinu ukončit a TG zesíťovat sítě. Konstrukt je pak ochladí na 4 °C po dobu 15-20 min, aby zkapalnit tištěné uprchlík inkoust, který je propláchnout zařízení pomocí studené mobilní média, zanechala za sebou otevřené potrubí, které slouží jako požadovaný tubulární sítě vložené do modulu ECM s nebo bez buněk v extratubular ECM prostor.

pomocí této metody jsme také vytvořili 3D architektury v sekvenci sestavení vrstvy po vrstvě. Například každá jednotlivá vrstva třívrstvé struktury znázorněné na obr. S10 byl konstruován pomocí upraveného tiskového protokolu, který zahrnuje dříve diskutované materiály a metody. Po vytištění první kanálky s uprchlíkem inkoust, vrstva ECM je obsazení v průběhu tisku a povoleno 20 min na gel při 37 °C před další proximálního tubulu vrstva je vytištěn s uprchlíkem inkoust na vrcholu nedávno rosolovité vrstvy. Tato postupná konstrukce zavádí 3D geometrii a umožňuje úspěšnou evakuaci všech kanálů nezávisle po výstavbě. Barviva rizikových reaktorů na bázi vody jsou perfundována kanály a excitována UV světlem pro vizualizaci.

pro dokončení procesu montáže 3D tkáňového čipu je každá konstrukce PT umístěna na opracovanou základnu z nerezové oceli a nahoře je umístěno silné akrylové víko. Víko a základna jsou upnuty dohromady čtyřmi šrouby, které tvoří těsnění kolem tištěného silikonového těsnění. Další, sterilní dva-zastavení peristaltické hadičky (PharMed BPT, 0,25 mm vnitřní průměr) je plná média a připojen k výstupu sterilní filtr, který je připojen k 10 ml stříkačky (firmy nordson EFD), která slouží jako mediální nádrže. Hodnota ptec média (určené pro růst, takže ATCC formulace plus 1% FBS, 1% aprotinin, a 1% anti-anti), která byla pro ekvilibraci >3 h v inkubátoru při 37 °C, 5% CO2 je přidán do média nádrž a hadičky od nádrže je připojen k výstupu z čipu (kovové duté perfuze pin). Stříkačka se pak používá k vyvíjení mírného tlaku na médium v barelu, což ho nutí vstoupit a úplně naplnit připojenou hadičku. Naplnění hadičky médiem před připojením k okruhu zabraňuje zavádění vzduchových bublin do systému. Pro dokončení perfuzního obvodu je silikonová hadička ze zásobníku připojena ke vstupnímu kovovému perfuznímu kolíku na čipu. Na vstupu a výstupu perfuzního čipu se přidávají hadicové svorky, aby se zabránilo nekontrolovanému průtoku při odpojení od peristaltického čerpadla, což může poškodit epitel nebo umožnit vniknutí vzduchových bublin do systému. Zásobník média se vždy vyrovnává s atmosférickými podmínkami v inkubátoru pomocí sterilního filtru na horní straně zásobníku média.

buněčná kultura

lidské zvěčněné Pteky (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) jsou kultivovány podle pokynů ATCC a používají se pro všechny pt modelové studie až do průchodu 20. Pro genové analýzy výraz, lidské primární RPTEC (Cell Science), zvěčněn PTECs (RPTEC-TERT1, Evercyte) a taric a498 (ATCC HTB-44) renální nádorové buňky jsou používány a kultivovány na dodavatele podle pokynů. Lidské neonatální dermální fibroblasty (HNDF), GFP exprimující (Angio-Proteomie) jsou kultivovány podle pokynů dodavatele a používají se až do průchodu 15.

Genové exprese analýzy

Lidské primární RPTEC (Cell Science), zvěčněn RPTEC-TERT1 (Evercyte) a taric a498 (ATCC HTB-44) renální nádorové buňky jsou pěstovány v 96jamkové desky podle dodavatele pokyny a shromažďovány v Den 3 po konfluence tím, že nahradí kultivačním médiu s 100 µl/jamka 1x RNA lysis směs (QuantiGene Zpracování Vzorku Kit, QS0101). Pak 40 µl lyzátu se smíchá s mRNA-zachytit magnetické korálky set (Panomics QuantiGene Plex Nastavit 12631, katalogové číslo 312631), inkubovat přes noc, zpracované pro rozvětvené DNA amplifikaci a analyzovány podle pokynů výrobce (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). Sonda PPIB se používá jako úklidový gen pro normalizaci. Údaje o intenzitě Fluorescence (FI) jsou prezentovány jako průměrná a směrodatná odchylka 3 biologických replikátů.

Cytokinové analýzy mediálního perfuzátu

Média perfuzátu jsou shromažďovány z tubulu po dobu 25 dnů po cele setí a skladovány při -80 °C. před analýzou. Pro cytokin profilování, supernatanty jsou rozmrazeny na ledu, ředěný 2x ve vzorku ředicího pufru (BioRad katalog #M60-009RDPD) a analyzovány pomocí Luminex technologie na bázi ELISA pomocí Bio-Plex Pro™ Human Chemokinový IL-6 (Set #171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) a MCP-1 (Set #171-BK36MR2) a Bio-Plex 200 Systémů (BioRad) podle pokynů výrobce. Údaje jsou uváděny jako průměrné koncentrace cytokinů a směrodatné odchylky technických triplikátů.

Epitelizaci a podélné kultury

Každý 3D PT konstrukt je prokrvený po dobu několika hodin s hodnota ptec médiích v inkubátoru před mobilní načítání/setí. Ptec (PTEC / TERT1, ATCC) jsou trypsinizovány ze své kultivační misky a koncentrovány v médiu na ~2 × 107 buněk / ml. Buněčná suspenze se potom vloží do perfuzního čipu výstupem (obr. S3b, c). Vložený konstrukt je umístěn příčně v inkubátoru po dobu několika hodin, a otočil o 180° a v průběhu více půl-hodinových intervalech, aby se umožnilo rovnoměrné setí trubičky stěny, pak inkubovány v tubulu bez průtoku přes noc. Následující den jsou neadherentní buňky vyplaveny z tubulu pod proudem gravitací. Poté se spustí perfúze čerstvého média a zbývající buňky se začnou shlukovat a poté růst z těchto kolonií (obr. S3f), dokud nedosáhnou soutoku přibližně 3 týdny po setí (obr. S3k). Během růstové fáze, PTECs jsou krmena hodnota ptec médií připraven za ATCC pokynů plus 1% aprotinin (EMD Millipore, který se používá k zpomalení degradace ECM), 1% fetální bovinní sérum (FBS) a 1% antibiotikum-antimykotické (Gibco). Po zrání se FBS odstraní a Ptec se zabalí do těsné epiteliální monovrstvy (film S2). 1. Den po výsevu, PTECs jsou vystaveny kontinuální, jednosměrné průtoku 1 µl/min, což se rovná smyková napětí, která kolísá mezi 0,1 a 0, 5 dyn/cm2 v závislosti na tubulu průřezu. Média jsou přiváděna peristaltickým čerpadlem v uzavřeném okruhu a měněna každé 2 dny.

studie absorpce albuminu

absorpce albuminu je hodnocena pro tištěné 3D PT modely i 2D kontroly. První kontrola se skládá z Ptec pěstovaných na plastu tkáňové kultury, zatímco druhá kontrola se skládá z Ptec pěstovaných na našem ECM. V každém případě se Ptec pěstují na soutok a nechávají se zrát v médiu bez séra. Lidský sérový albumin konjugovaný s FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030)je suspendován v PTEC médiu v dávce 50 µg / ml. Všechny vzorky se inkubují s HSA-FITC ve svém médiu po dobu 2 h (v případě perfuze se perfunduje otevřeným lumenem). Po expozici jsou všechny vzorky promyty 3x objemem a poté trypsinizovány 10x trypsinem, aby se shromáždily jednotlivé buňky. Buňky jsou fixovány a kontrastovány primárními a sekundárními protilátkami pro megalin (tabulka S2 uvádí specifické použité protilátky). Buňky z těchto vzorků a nahé buňky jsou analyzovány průtokovou cytometrií (BD LSR Fortessa) a data jsou shromažďována z n = 10 000 buněk na vzorek. Pro získání obrazů HSA-FITC a megalin v Ptec, vzorky jsou fixovány na místě formalinem místo toho, aby byly po kroku praní vyzinizovány. Tyto vzorky jsou kontrastovány pro megalin a zobrazovány pomocí konfokální mikroskopie (Zeiss LSM710).

testování cyklosporinu a

je zkoumán účinek CysA na 2D kontroly i bioprinted 3D PTs. Ve 2D jsou buňky naočkovány v 96jamkovém formátu na plast tkáňové kultury a pěstovány do soutoku. Jsou krmena médii podle pokynů ATCC. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) je pozastavena v jejich média v různých koncentracích a inkubovány s buňkami po dobu 24 h. Životaschopnost testu pomocí (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-trifenyltetrazolium) v přítomnosti phenazine methosulfate (MTS) je běh na 24 h po expozici. Tento test je dokončen na PTECs na začátku konfluence, tím, že CysA do buněk v den, kdy dosáhnou konfluence, stejně jako pozdní konfluence, tím, že CysA několik dní po dosažení konfluence. Výsledky toxicity jsou pro každý případ podobné (obr. 5n). Pro 3D PTs, CysA je přiváděn v různých koncentracích přes otevřené lumen zralý kanálků po dosažení konfluence (v ~3 týden mark), kde žádné sérum je zahrnuta v médiích minimálně 10 dní. Při 24 h mark po expozici CysA se provádí test těsnosti FITC-dextran (popsaný níže) za účelem posouzení a kvantifikace poruch bariérové funkce Ptec. Ihned po, PT je stanovena pomocí 10% pufrovaném formalínu po dobu 1 h a kontrastním pro aktin a DAPI (Tabulka S2 uvádí konkrétní skvrny).

Difúzní propustnost měření

posoudit bariérové funkce epitelu ve 3D, difúzní propustnost je vyčíslena na účinné hodnota ptec médií v otevřené lumen obsahující 25 µg/mL FITC-konjugované 70 kDa dextran (FITC-Dex, Sigma produktu 46945) rychlostí 15 µL/min po dobu 3 min a 1 µL/min poté pro ~30-45 min. Celý test se provádí za zobrazení živých buněk jak s tubulem, tak s okolním ECM v zorném poli (obr. S9). Difúzní vzorec FITC-Dex je detekován pomocí širokoúhlého fluorescenčního mikroskopu (Zeiss Axiovert 40 CFL). Fluorescenční obrazy jsou zachyceny před perfuzí a každé 3 až 5 minut po dobu 30-45 minut. Difúzní propustnost pro FITC-Dex se vypočítá kvantifikaci změn ve fluorescenční intenzita v průběhu času pomocí následujících equation34;

Pd je difúzní koeficient propustnosti, I1 je průměrná intenzita v počáteční časový bod, I2 je průměrná intenzita v t ~ 30-45 min, Ib je pozadí intenzita (snímek pořízený před perfuze FITC-Dex), a d je průměr kanálu. Jiní vědci uvedli, že Ptec mohou resorbovat dextran39, což by vedlo k mírně vyšším hodnotám měřené difuzní permeability.

zkoumali Jsme také bariérové vlastnosti našich lemované epitelu tubulů pomocí nízkomolekulární sloučenina, inulin (4.5 kDa), který není ani vstřebá, ani vylučován in vivo PTECs pomocí stejné metody popsané výše. Konkrétně, inulin-FITC (Sigma produktu F3272) se rozpustí ve vyhřáté hodnota ptec média se 100 µg/mL a perfundovaného v otevřené lumen rychlostí 20 µL/min po dobu 3 min a 1,5 µL/min, poté za ~15 min. Celý test se provádí za zobrazení živých buněk jak s tubulem, tak s okolním ECM v zorném poli (obr. S7). Difúzní vzorec FITC-inulinu je detekován pomocí širokoúhlého fluorescenčního mikroskopu (Leica). Fluorescenční snímky jsou pořízené s bránou zdroj světla a pohybu kontrolované fázi před perfuze a každé 3 až 5 min po 15 min období sbírat technické trojím provedení měření.

Elektronová mikroskopie

Pro transmisní elektronová mikroskopie (TEM), PTECs v 2D nebo 3D architektur nebo zdravé lidské ledviny tkáně získané od standardní biopsie před transplantací jsou fixovány pomocí 2,5% glutaraldehyd, 1.25% paraformaldehyd, a 0,03% kyselinou pikrové v 0,1 M roztoku cacodylate pufru (pH 7.4) pro minimálně několik hodin. Malé vzorky (1 mm × 1 mm) se odstraní a promyjí v 0,1 M kakodylát pufru a koupají se v 1% osmiumtetroxidu (OsO4) (EMS) a 1.5% potassiumferrocyanide (KFeCN6) (Sigma) po dobu 1 h, omýt vodou 3x a inkubovány v 1% vodném uranyl acetát (EMS) po dobu 1 h, následuje 2 myje ve vodě a následné dehydratace různého stupně alkoholu (10 min každý; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Vzorky se pak vloží do propylenoxidu (EMS)po dobu 1 hodiny a inkubují se přes noc ve směsi propylenoxidu a TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kanada). Následující den jsou vzorky vloženy do Eponu TAAB a polymerovány při 60 °C po dobu 48 hodin. Ultratenkých řezů (o 60 nm), jsou řezané na Ultracut Reichert-S mikrotom, umístěn na měděné mřížky potřísněné vést citrát a zkoumal v JEOL 1200EX transmisního elektronového mikroskopu a snímky jsou zaznamenány s AMT 2k CCD kamery. Analýza obrazu se provádí pomocí softwaru ImageJ.

Pro skenovací elektronové mikroskopie (SEM), perfundovaného PTECs ve 3D jsou upevněny pomocí 10% pufrovaném formalínu po dobu 1 h. Vzorky, které jsou tenké plátky (~1 mm) vystavit buňky ohraničující otevřené lumen. Fixativa je smýt pomocí PBSx2 a následné dehydratace různého stupně ethanolu (20 min každý; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Vzorky se pak umístí do 50% ethanolu a 50% hexamethyldisilazanu (HMDS) po dobu 30 minut a poté 100% HMDS 3 × 30 minut. Všechny kroky se provádějí v uzavřené a uzavřené skleněné nádobě. Po konečném promytí HMDS se vzorky odstraní a umístí do otevřené nádoby pod N2 v digestoři, aby se uschly. Sušené vzorky jsou namontovány na hliníkový čep uchycení pomocí vodivé uhlíkové pásky, prskat potažené zlatem, a odrážel se Tescan Vega-SEM.

Imunostaining

Imunostaining následovaný konfokální mikroskopií se používá k hodnocení buněčné lokalizace proteinů ve 2D a 3D modelech PTEC. Před imunostainingem se každý konstrukt promyje PBS a poté se fixuje po dobu 20 minut až 1 h za použití 10% pufrovaného formalinu. Do fixačního roztoku je odstraněn pomocí několika promytí v PBS po dobu několika hodin, a pak blokovány přes noc pomocí 1 wt% bovinního sérového albuminu (BSA) v PBS. Primární protilátky k buněčné bílkoviny nebo biomarkerů zájmu jsou inkubovány s konstrukty pro 1 den na ředění uvedené v Tabulce S2 v roztoku 0,5 wt% BSA a 0.125 wt% Triton X-100. Odstranění nevázaných primárních protilátek se provádí promývacím krokem proti roztoku PBS nebo 0, 5% hmotnostních BSA a 0, 125% hmotnostních Tritonu X-100 v PBS po dobu 1 dne. Sekundární protilátky se inkubují s konstrukty po dobu 1 dne při ředění uvedených v tabulce S2 v roztoku 0, 5 hmotnostních % BSA a 0, 125 hmotnostních% Triton X-100 v PBS. Vzorky jsou potřísněny NucBlue nebo ActinGreen po dobu 2 h a poté se promyjí po dobu 1 dne v PBS před zobrazením.

vykreslování Obrázků a analýzu

Phase smlouvy mikroskopie se provádí pomocí obráceného Leica DM IL rozsahu s cíli v rozmezí od 1,25 X až 40X. Konfokální mikroskopie se provádí pomocí vzpřímené Zeiss LSM 710 s ponořením do vody cílů v rozmezí od 5X do 40X využívající spektrální lasery na 405, 488, 514, 561, a 633 nm vlnové délky. Rekonstrukce obrazu z-stacků jsou prováděny v ImageJ pomocí funkce z-projekce s nastavením maximální intenzity Pixelů. Jakékoli zvýšení jasu se provádí rovnoměrně napříč celým z-promítaným obrazem. 3D rekonstrukce obrazu a rotující filmy (Movie S3) jsou prováděny pomocí softwaru Imaris. Nový CytoSMART (Lonza) v inkubátoru se používá k zachycení časosběrného zobrazování (film S2). Analýza obrazu pro kvantifikaci difuzní permeability je prováděna pomocí vlastních skriptů MATLAB využívajících dříve hlášené metody34. Analýza obrazu TEM se provádí pomocí softwaru ImageJ k měření výšky buněk (N ≥ 50), hustoty mikrovilli (n ≥ 25) a délky mikrovilli (n ≥ 150) na nejméně 3 nezávislých vzorcích pro každý stav.

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka. Statistická analýza je provedena pomocí prostředí MATLAB a statistické významnosti je stanovena na hodnotě p < 0.05, jak určována pomocí ANOVA Tukey více párového srovnání testu. Různé úrovně významnosti (hodnoty p) jsou označeny hvězdičkami a specifické hodnoty p jsou uvedeny v každé legendě obrázku.