studované subjekty, klinické vzorky a genotypizace HLA. Všechny subjekty s anamnézou krevní transfúze byly ze studie vyloučeny. Třicet dva rodin s anamnézou simplex sklerodermie bylo přijato a studováno pro alely třídy hla II a třídy I; 3 generace byly studovány pro 20 rodin a 2 generace pro 12 rodin. Pro vstup do studia pro všechny ženy s dětmi byly vyžadovány tři generace a účast všech dětí byla nutná, protože mikrochimerismus mohl pocházet z matky nebo z dítěte v těchto předmětech. Účast mužů, dětí a nikdy těhotných žen zahrnovala 2 generace (tj. Jeden pacient se sklerodermií byl dvojče; neovlivněné dvojče bylo také přijato do studie. Bylo přijato třicet tři zdravých kontrolních rodin, včetně 22 S 3 generacemi a 11 s 2 generacemi. Genotypizace HLA byla dokončena pro celkem 254 jedinců: 128 v rodinách sklerodermie a 126 v kontrolách. Někteří další členové rodiny byli zahrnuti, aby potvrdili přiřazení haplotypu HLA. Z této databáze, subjekty byly vybrány pro další studium, když matka subjektu měla nesdílenou alelu HLA, na kterou se zaměřily testy specifické pro HLA. Všem subjektům byl udělen informovaný souhlas schválený institucionální revizní komisí Fred Hutchinson Cancer Research Center.

Pbmc byly izolovány z celé heparinizovaný krev ředění v HBSS, následuje Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko) gradientní centrifugace na 1.077 g/mL. U některých dětí byla DNA extrahována z vlasových kořenů pro typizaci HLA, jak bylo popsáno výše (9). Genomová DNA byla extrahována z Pbmc pomocí sady pro nukleovou extrakci Isoquick (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), podle pokynů výrobce, a promíchán v 10 mM Tris-HCl (pH 9.0). Množství a čistota DNA byla stanovena standardními spektrofotometrickými metodami. U některých subjektů byla DNA extrahována přímo ze vzorků plné krve.

na bázi DNA psaní s sekvence specifických oligonukleotidových sond panely byl použit k identifikaci konkrétních alel na DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 a DQB1 lokusů. Pro DRB1, počáteční nízkým rozlišením test detekuje DRB1 rodiny DBR1*01, DRB1*14 a následuje 1 nebo více high-rozlišení testy, které identifikují konkrétní DRB1 alel, jak je popsáno dříve (10, 11). Alely DQA1 a DQB1 byly stanoveny metodami podobnými těm, které byly popsány dříve (9), s přídavnými sondami pro detekci nově identifikovaných alel (12). Antigeny HLA třídy I byly stanoveny pomocí standardního testu lymfocytotoxicity, který rozlišuje 20 hla-A, 30 HLA-B a 8 hla-Cw antigenů. Některé vzorky byly podrobeny sekvenování za účelem stanovení specifických alel HLA třídy I (13). Potvrdit HLA alel a antigenů úkoly a homozygotnosti, více členů rodiny byly genotyp — včetně otce a sourozenců subjektů, pokud je k dispozici.

hla-specifické PCR primery. Primerové sekvence byly navrženy na základě všech známých alelových sekvencí (12). Syntéza primeru byla provedena Oligos atd. (Wilsonville, Oregon, USA). Jedna sada primerů byla navržena tak, aby se zaměřila na polymorfismus HLA třídy I a 3 cílené polymorfismy HLA třídy II. Cíl HLA-B44, primer byl navržen tak, že zesiluje skupina HLA-B alel na základě polymorfismů v místech, 66, 69 a 75 exon 3 a další skupina HLA-B alel na základě polymorfismu v pozici 229 exon 3. Kombinace primerů specificky zesiluje alely HLA-B44 a vytváří fragment 190 bp. Všechny primery specifické pro DRB byly navrženy k amplifikaci skupin alely na základě sekvenčních polymorfismů v hypervariabilní oblasti exonu 2. Pro HLA-DRB5*01, jeden primer zesiluje skupina DRB5*01 alely na základě polymorfismy v pozicích 25, 26, 31, 32 a 38, a druhý zesiluje skupina DRB5*01 alely na základě polymorfismů mezi pozicemi 215 a 231. Kombinace primerů specificky zesiluje alely HLA-DRB5 * 01 a vytváří fragment 210 bp. Pro HLA-DRB1*04, jeden primer zesiluje skupiny DRB1*04 alely na základě polymorfismy v pozicích 25, 26, 31 a 36, a druhý zesiluje skupiny DRB1*04 alely na základě polymorfismů v místech, 97 a 110. Kombinace primerů specificky zesiluje DRB1 * 04 a vytváří fragment 104 bp. Další diskriminace mezi DRB1*04 alely bylo dosaženo pomocí bývalý primer spolu s 1 2 primery, které rozlišovat dimorfismu na pozici 258 (kodon 86), produkující 263-bp fragment. Pro HLA-DRB1*11, jeden primer zesiluje skupiny DRB1*11 alel na základě polymorfismy v pozicích 25, 26, 28, 30, 31, 32, a 35 exon 2, a druhý primer zesiluje skupiny DRB1*11 alel na základě polymorfismy v pozicích 173 a 174 exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR reakce byly prováděny v objemu 50 µL obsahující 1.25–1.5 µg genomické DNA, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0.001% wt/vol želatina, 260 µmol/L každý deoxynucleotide, 0.5 U, Perfektní Zápas PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, Kalifornie, USA), 2.5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, spojené státy americké), a 20 pmol každého HLA-specifických primerů. K vytvoření konečného objemu 50 µL byla přidána ultračistá voda. Zesílení se skládala z 5 minut při 96°C, 35 cyklů při 95°C po dobu 35 sekund, a na 65°C za 35 sekund pro HLA-B44 (58.5°C pro DRB5*01; 72°C pro DRB1*04; 64.5°C pro DRB1*11), pak 72°C 1 minutu, s konečným prodloužení kroku při 72°C po dobu 10 minut. Optimální amplifikace, citlivost, a specificita byla dosažena titrací MgCl2, a koncentrace primeru, počet termocyklů, a teplota žíhání. Všechny amplifikace byly provedeny v systému GeneAmp 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Test citlivosti byla stanovena smísením experimenty, v nichž cílové DNA byla sériově naředěn a přidány do pevnou částku pozadí DNA odpovídající alely daného předmětu. HLA-B44– a DRB5*01-specifické PCR testy byli schopni detekovat alespoň 1 cílové buňky v pozadí 500,000 buněk, HLA-DRB1*04 a DRB1*11-specifické PCR testy byli schopni detekovat alespoň 1 cílové buňky v pozadí 100 000 buněk. Každý test PCR zahrnoval následující kontroly: a) pozitivní kontrolu DNA z buněčné linie s alelou HLA zájmu (0,2-0,5 µg); (b) pozitivní kontrola od tématu matka (0.2–0.5 µg); (c) negativní kontrola DNA z buněčné linie se stejnou HLA alel jako předmět (1.25 µg a 0,35 µg); a (d) negativní kontrola skládající se ze všech činidel pro PCR bez DNA. Produkty PCR byly elektroforovány při konstantním napětí 100 v po dobu 1 hodiny v 6% nebo 8% prefabrikovaných TBE gelech Pomocí Mini-článku Novex Xcell II (Novex, San Diego, Kalifornie, USA). Každý gel zahrnoval pozitivní a negativní kontroly PCR a žebřík 100 bp (SLL-100; Gensura, Del Mar, Kalifornie, USA). Gely byly obarveny stříbrnou skvrnou (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornie, USA) a suší se sušicím systémem DryEase Gel (Novex). DNA extrahovaná z plné krve byla testována ve 4 vzorcích nedostatečného množství pro izolaci Pbmc. Všechny testy byly provedeny ve dvou vyhotoveních a většina vzorků byla testována více než jednou.

PCR preventivní opatření. Byla použita extrémní opatrnost, aby se zabránilo možné kontaminaci PCR a zjistila ji. Pro separaci PBMC byly použity oddělené oblasti, extrakce genomové DNA, nastavení a amplifikace PCR, a analýza produktů PCR, s testy před a po PCR prováděnými v samostatných laboratořích. Tipy pro pipety odolné vůči aerosolu (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Kalifornie, USA) byly použity ve všech experimentech a do všech amplifikací PCR bylo zahrnuto více negativních kontrol.

sekvenování produktů PCR specifických pro HLA. Sedm mikrolitrů počátečního produktu PCR specifického pro hla bylo podrobeno dalších 40 cyklům amplifikace za použití původních termocyklických parametrů. Třicet mikrolitru tento PCR produkt byl electrophoresed v 1,75% ultračisté agarózového gelu (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) a potřísněné roztokem ethidium bromidu (0,5 µg/mL). Kapela byla vyříznuta, eluována a čištěna pomocí soupravy pro extrakci gelu QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornie, USA). Purifikovaný PCR produkt byl eluován do 30 µL 10 mmol Tris-HCl (pH 9.0), a 100 ng byl přidán do reakční směsi obsahující 8.0 µL sekvenování činidla pre-mix (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol 5′ nebo 3′ primer a 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Byla přidána ultračistá voda, aby se vytvořil konečný objem 20 µL. Sekvenční reakční směsi byly zahřát na 96°C po dobu 3 minut v GeneAmp Systém 9600 termocykleru, následována 25 cykly 96°C po dobu 10 sekund, 50°C po dobu 5 sekund a 60°C po dobu 4 minut. Výsledné PCR produkty byly kolonově čištěny a elektroforovány, jak je uvedeno výše. Sense a antisense sekvence byly stanoveny ve dvojím vyhotovení pro hla-specifické PCR produkty subjektu a matky, stejně jako pro PCR produkty pozitivní kontrolní buněčné linie. Sekvenční analýza byla provedena pomocí softwaru Wisconsin Package verze 9.1 od Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA).

Příprava cytospinového sklíčka a In situ hybridizace. Cytospin preparátech, byly analyzovány na přítomnost X a Y chromozom–specifické sekvence, pomocí techniky vyvinuté v Fred Hutchinson Cancer Research Center Molekulární Cytogenetiky Laboratoř pro kvantitativní analýzu chimérismus v sex-neodpovídající transplantaci kmenových buněk párů (14). Vzorky cytospinu samčích buněk byly připraveny centrifugací 30 000-60 000 čerstvě oddělených Pbmc na skleněné sklíčka, 300 µL na sklíčko. Sklíčka byla až do použití uložena v vysoušecí komoře. X chromozom–specifické sondy DXZ1 (15) byl nick-přeloženo s digoxigenin, a Y chromozom–specifické sondy, DYZ1 (16) byl nick-přeloženo s biotin. XY sondy směs měla konečné koncentraci 0,5 µg/mL každého sondy na hybridizační pufr 50% formamid, 2× SSC (0,3 M roztoku chloridu sodného a 0,03 M citrát sodný ), 10% dextran sulfát. Byl denaturován při 72°C po dobu 5 minut, ochlazen na ledu a aplikován na sklíčko. Sklíčka byla trávena v pepsinu (0, 1 mg/mL v 0.01 M HCl) při 37°C po dobu 3 minut, pevné v 4% pufrovaném formalínu po dobu 15 minut, opláchnout v PBS, dehydrované v ethanolu (70%, 95% a 100%), a suší se na vzduchu. Snímky byly denaturované působením ve 2 x SSC (72°C) po dobu 10 minut, 70% formamid, 2× SSC (72°C) po dobu 3 minut, dehydrataci v etanolu série (-20°C) a suší se na vzduchu. Na sklíčko bylo naneseno deset mikrolitrů sondy a poté namontováno pod krycí sklíčko (22 × 22 mm) utěsněné gumovým cementem. Inkuboval se přes noc při 42°C ve zvlhčené komoře. Sklíčka byla promyta 55% formamidem, 2× SSC (45°C) po dobu 15 minut a 2× SSC (pokojová teplota) po dobu 5 minut. Sonda signály byly současně detekovány s fluorescein-spolu anti-digoxigenin (1:500 ředění; Boehringer Mannheim-Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) a Texas red–spolu avidin (1:500 ředění; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornie, USA) po dobu 30 minut při pokojové teplotě ve tmě. Po promytí 2× SSC a PBS byly namontovány s Vectashield (Vector Laboratories). Snímky byly hodnoceny přímo pomocí Nikon E600 epifluorescence mikroskop s 100-W rtuťová lampa vybavena vhodnými single, double a triple band-pass filtry. Byly vyčísleny pouze buňky se 2 viditelnými chromozomálními signály, bez použití elektronického vylepšení.