Abstrakt

Myoepithelium je přítomen v psí prsní nádory, jako by odpočíval a proliferační suprabazálních a vřeteno a hvězdicovité intersticiální buňky. Cílem tohoto příspěvku bylo vyhodnotit panelu markerů pro identifikaci čtyř různých myoepiteliální buňky morfologické typy v normální a nádorové prsní žlázy a k vyšetření imunohistochemické změny z epitelové a mezenchymální fenotyp. Cytokeratinu 19 (CK19), cytokeratin 5/6 (CK5/6), cytokeratinu 14 (CK14), estrogenní receptor (ER), p63 proteinu, vimentinu (VIM), a α-smooth muscle aktin (Α-SMA), protilátky byly použity na 29 novotvary (3 benigní a 3 maligní myoepiteliální nádorů, 7 karcinomů u benigní-smíšené nádory a 16 komplexní karcinomy) a na normální tkáně prsních žláz. Všechny tyto protilátky byly také testovány na 3 prsních tkáních od zvířat bez mléčné patologie. Myoepiteliální markery byly dobře vyjádřeny v suprabazálních buněk, a postupně ztratil v pohyblivých typů, s hvězdicovité buňky zachování jen VIM výraz typický pro mesenchyma. Er označil některé klidové a pohyblivé myoepiteliální buňky. Na základě našich výsledků navrhujeme přechod z myoepiteliální nepohyblivé buňky do migračních fibroblast-like buněk. Tento přechod a charakterizaci o imunohistochemické panel pro odpočinek a pohyblivých myoepiteliální buňky vrhnout více světla na biologické chování myoepiteliální buňky.

1. Úvod

nádory mléčné žlázy psů jsou tvořeny jak epiteliálními (epitelovými a myoepitelovými), tak mezenchymálními složkami. O původu mezenchymálních buněk se stále diskutuje. Zvýšená frekvence nádorů vykazujících proliferaci myoepiteliálních nebo bazálních buněk je jedinečným rysem nádorů psích mléčných žláz .

V normální mléčné žláze, lumina se vymezil tím, že vnitřní vrstva polarizované epitelové buňky spočívající na dvou vnějších nebo bazální vrstvy epiteliálních a myoepiteliálních buněk . Jak bazální a myoepiteliální buňky syntetizovat bazální membrána kanálků a sklípků a tvoří strukturální bariéru mezi luminal epitelové buňky a okolního stromatu . V kanálech tvoří myoepiteliální buňky téměř souvislou vrstvu buněk orientovaných rovnoběžně s dlouhou osou kanálků. Tato vrstva obklopuje luminální epiteliální buňky a odděluje je od bazální membrány a stromy. V alveolech jsou myoepiteliální buňky diskontinuální a vytvářejí síť podobnou koši kolem alveol, což umožňuje některým luminálním epiteliálním buňkám přímý kontakt s bazální membránou . Proto myoepithelium se nejen nachází v ideální pozici pro komunikaci mezi těmito dvěma prostory, ale je také umístěn tak, aby poskytnout důležité regulační signály pro udržení normální buněčné struktury .

na základě imunohistochemie vykazují tři vrstvy buněk normální mléčné žlázy různé markery: luminální epitel je označen tím, CK19, a bazální buňky a myoepiteliální buňky jsou obarveny CK5/6 a CK14 a p63, Alfa-SMA, a VIM . Myoepiteliální buňky jsou kontraktilní prvky vykazující kombinovaný imunoprofil epitelu a hladkého svalstva. Výše uvedené markery jsou exprimovány v cytoplazmě, s výjimkou p63, který je jaderným markerem . Myoepiteliální buněčná vrstva je jediným zdrojem tumor supresoru p63, který je významně inhibován na proliferaci a invazi přidružených nádorových buněk . Kromě toho jsou bazální myoepiteliální buňky v normální mléčné žláze příležitostně značeny ER protilátkou, která se používá pro molekulární klasifikaci nádorů psích mléčných žláz .

Odlišné myoepiteliální morfologie buněk mohou být uznány v psí složité a smíšené nádory: odpočinek a proliferační suprabazálních myoepiteliální buňky a vřeteno a hvězdicovité pohyblivých intersticiální myoepiteliální buňky. Suprabazálních buněk jsou umístěna mezi bazální membránou a luminálního epitelu a vykazují zploštělé vřeteno (klidové buňky) nebo polygonální morfologií (proliferativní buňky). Intersticiální buňky jsou často uspořádány v pevných hnízdech připojených k epiteliálním prvkům nebo izolovaných v intersticiu . Vřetenové a stelátové myoepiteliální buňky se diferencují směrem k obecnějšímu kontraktilnímu fenotypu .

intersticiální myoepiteliální buňky se nakonec mohou stát buňkami podobnými fibroblastům, které vykazují pouze imunoreaktivitu VIM . Myoepiteliální diferenciace mohou vyústit v tvorbu různých mezenchymálních tkání, včetně chrupavky a kosti v psí mléčné smíšený nádor.

získání typických rysů mezenchymálních buněk pravděpodobně pochází z epiteliálně-mezenchymálního přechodu (EMT). EMT je biologický jev, který umožňuje polarizované epitelové buňky, které se obvykle interaguje s bazální membrány prostřednictvím jeho bazální hladině, aby se podrobil několika biochemických změn, umožňuje předpokládat, že vlastnosti a funkce mezenchymálních buněk .

Tento dokument se bude soustředit na různé aspekty myoepiteliálních buněk a nádorů mléčné žlázy u psů, konkrétně (1) charakterizace čtyři různé myoepiteliální buňky morfologické typy v normální a nádorové prsní žlázy pomocí panelu protilátek a (2) imunohistochemické změny v myoepiteliální buňky z epitelové a mezenchymální fenotyp.

2. Materiály a metody

2.1. Vzorky

vzorky mléčné žlázy 29 fen byly získány z databáze Anatomopatologické služby Fakulty veterinárního lékařství v Bologni. Předměty patřily různých plemen: kříženec (𝑛=13), německý ovčák (𝑛=3), Pudl (𝑛=3), Jorkšírský Teriér (𝑛=3), Jezevčík (𝑛=2), Setra (𝑛=1), Ukazatel (𝑛=1), kokršpaněl (𝑛=1), Knírač (𝑛=1), a Sibiřský Husky (𝑛=1); všechny byly ženy, s průměrným věkem 9.20±2.28 let (průměr ± SD). Nádory se skládala z: 3 benigní myoepiteliální nádorů, 3 maligní myoepiteliální nádorů, 7 karcinomů u benigní smíšené nádory, a 16 komplexní karcinomy (poslední dvě skupiny byly rozlišeny přítomností chrupavky a/nebo kosti ve smíšené nádory). Kromě toho bylo hodnoceno 29 vzorků z normálních mléčných žláz stejné nádorové linie a 3 vzorky mléčných žláz od 3 zdravých nemammárních samic nesoucích nádor.

nádory byly klasifikovány podle Misdorp et al. a Goldschmidt et al. do benigní myoepiteliální nádory: vzácné nádory složené z myoepiteliální buňky uspořádané do krátkých svazků smíchá s extracelulární fibrilární bazofilní materiál; maligní myoepiteliální nádory: odlišné od benigní varianta s více polymorfní myoepiteliálních buněk; komplex karcinom: karcinom složenou z lumina epiteliální a myoepiteliální součásti; karcinom in benigní nádor: nádor s ložisky maligní-objevují epitelové buňky nebo odlišné uzliny těchto buněk vyskytující se spolu s mezenchymálních buněk, které přinesly chrupavky a/nebo kosti, případně v kombinaci s fibrózní tkáně.

2.2. Imunohistochemie

čtyři µm tlusté řezy byly vyříznuty z formalinem fixovaných parafinových bloků obsahujících reprezentativní vzorky nádoru. Imunohistochemie pro následující markery byla provedena na těchto tkáních: CK19, ER, CK5/6, CK14, VIM, Alpha-SMA, p63.

sekce byly odparafinovány v toluenu a rehydratovány. Endogenní peroxidáza byla blokována ponořením do 0,3% peroxidu vodíku po dobu 20 minut. Sekce byly poté opláchnuty v Tris pufru. Antigen retrieval byla provedena s citrátovým pufrem (2.1 g kyselina citronová monohydrát/l destilované vody), pH 6,0 (kromě pro CK5/6 a ER, které se používá EDTA, pH 8.0), a topení pro dva 5 min období v mikrovlnné troubě na 750 W, následuje ochlazení na teplotu místnosti po dobu 20 min. Primární protilátky jsou shrnuty v tabulce 1. Všechny primární protilátky byly inkubovány přes noc při 4°C, následuje komerční streptavidin-biotin-peroxidáza technika (Kit LSAB, Dako, Amsterdam, Nizozemsko). Jako chromogen byl použit diaminobenzidin (0,05% po dobu 10 minut při pokojové teplotě). Diapozitivy byly kontrastovány s Papanicolaouovým hematoxylinem.

Jako negativní kontrola, primární protilátka byla nahrazena irelevantní, izotypů-uzavřeno protilátek ovládání pro nespecifické vazby sekundární protilátky. Pozitivní tkáně ovládání pomocí stejné IHC protokoly zahrnuty psí normální mléčné žláze (anti-CK19, -ER, -CK14, -VIM, Alfa-SMA, -p63 protilátky) a psí kůže (anti-CK5/6).

počet pozitivních buněk tím, že každá značka byla vypočtena semiquantitatively: − = žádné obarvené buňky, ± = méně než 5% pozitivních buněk, + = 5-50% pozitivních buněk, ++ = více než 50% pozitivních buněk. Případy byly považovány za pozitivní pro ER, když bylo pozorováno jaderné barvení v nejméně 5% nádorových buňkách .

3. Výsledky

čtyři typy myoepiteliálních buněk byly rozpoznány na základě jejich morfologie. Klidová podtyp vystavoval protáhlé rysy vřetenité buňky v těsném kontaktu s luminální epitelu buňky, stejně jako proliferující suprabazálních buněk, které místo toho ukázal, polygonální tvar (viz Obrázek 1(a)). Intersticiální pohyblivé buňky byly pozorovány jak tvořící hnízda (hnízda lemovaná vřetenem, tak stelátové buňky představovaly jádro hnízda) a izolovány v intersticiu(Obrázek 2 (a)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Obrázek 1

Suprabazálních myoepiteliální buňky: odpočinek (tenké šipky) a proliferativní (tlusté šipky) buněk. Imunohistochemické exprese panelu protilátek uplatňované IHC, 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 protilátek značení cytoplazmě; (c) anti-ER protilátek značení jader; (d) anti-CK 5/6 protilátek značení cytoplazmě; (e) anti-CK14 protilátek značení cytoplazmě; (f) anti-vim protilátky označující cytoplazmu; (g) anti-alfa-SMA protilátky označující cytoplazmatickou membránu; (h) anti-p63 protilátky označující jádra.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anti-vim protilátky označující cytoplazmu; (g) anti-alfa-SMA protilátky označující cytoplazmatickou membránu; (h) anti-p63 protilátky označující jádra.

3.1. Normální Prsní Žláza

V 3 kontroly případech, vše odpočívá a proliferační suprabazálních myoepiteliální buňky byly označeny p63, CK14, Alfa-SMA, a VIM. Klidové a proliferativní suprabazální myoepiteliální buňky neexprimovaly CK19 v žádném z případů.

3.2. Prsní Tkáň ze Stejné Linii Prsní Nádor,

V 29 normálních tkání ve stejné linii jako nádory, vše odpočívá a proliferační suprabazálních myoepiteliální buňky byly označeny p63, CK14, Alfa-SMA, a VIM. CK5/6 byla pozitivní ve všech kromě čtyř případů a ER byla detekována ve 12 případech. Exprese CK19 byla pozorována pouze v luminálním epitelu. Myoepiteliální pohyblivé intersticiální buňky nebyly pozorovány. Všechny výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

3.3. Prsní Nádory,

Imunohistochemické výsledky pro suprabazálních (Obrázek 1) a pohyblivých buněk (Obrázek 2), pomocí p63, CK14, CK5/6, CK19, Alfa-SMA, VIM, a ER jsou shrnuty v Tabulce 2. CK5 / 6 značeno: suprabazální klidové buňky v 16 z 29 případů (5 karcinomů u benigních smíšených nádorů a 11 komplexních karcinomů). CK 5/6 také označil proliferativní suprabazální a vřetenové pohyblivé buňky v 10 případech (3 karcinomy u benigních smíšených nádorů a 7 komplexních karcinomů). Hvězdicovité pohyblivé buňky byly přítomny ve 25 případech (1 benigní nádor myoepiteliální, 3 maligní myoepiteliální nádory, 5 karcinomů u benigní smíšené nádory a 15 komplexní karcinomy), ale byly negativní pro CK5/6. Chrupavka v mléčných smíšených nádorech byla vždy negativní.

CK14 ukázal pozitivitu, a to ve 23 případech, v klidové buňky (s výjimkou 1 komplexní karcinom a benigní a maligní myoepiteliální nádory), ve 22 případech v proliferujících buněk (6 karcinomů u benigní smíšené nádory a 15 komplexní karcinomů) s trend ztratit výraz, když se tyto buňky získala více pohyblivých fenotyp vřetena buněk (pozitivní za 2 benigní a 3 maligní myoepiteliální nádorů, 2 karcinomy v benigní smíšené nádory a 2 komplexní karcinomy). Chondrocyty smíšených nádorů byly negativní.

VIM byl pozitivní v suprabazálních buňkách ve 23 případech karcinomu v benigním nádoru a komplexním karcinomu a v pohyblivých myoepiteliálních buňkách ve všech 29 případech. Stromální buňky byly ve všech případech pozitivní. Chrupavka byla vim pozitivní u všech 7 karcinomů u benigních smíšených nádorů.

alfa-SMA značené klidové a proliferativní suprabazální myoepiteliální buňky u 23 karcinomů u benigních smíšených nádorů a komplexních karcinomů. Vřetenové buňky v 10 případech (5 karcinomů v benigním smíšeném nádoru a 5 komplexních karcinomů) vykazovaly pozitivitu na alfa-SMA. V každém případě, s výjimkou dvou komplexních karcinomů, byly hvězdicové buňky negativní. Stroma vykazovala pozitivitu pouze v 6 případech(1 karcinom v benigním smíšeném nádoru a 5 komplexních karcinomů).

P63 byla zjištěna v odpočívá a proliferační suprabazálních myoepiteliální buňky z 23 případů karcinomu v benigní smíšený nádor a komplexní karcinom. Všechny vřetenové a stelátové pohyblivé buňky byly negativní. Stromální buňky a chrupavka byly negativní.

er exprese byla přítomna v 11 suprabazálních myoepiteliálních buňkách (4 karcinomy v benigních smíšených nádorech a 7 komplexních karcinomech); vřetenové a stelátové pohyblivé buňky byly pozitivní v 9 případech (3 karcinomy u benigních smíšených nádorů a 6 komplexních karcinomů). Chrupavka smíšených nádorů byla negativní.

Odpočinek a proliferační suprabazálních a vřeteno/hvězdicovité pohyblivých myoepiteliální buňky nevyjádřil CK19 v každém nádorů zkoumal. Chrupavka smíšených nádorů byla také negativní pro CK19.

4. Diskuse

Na základě zjištění Gama et al. a Tateyama a kol. v mléčné žláze jsou přítomny čtyři morfologické typy myoepiteliálních buněk: klidové a proliferativní suprabazální myoepiteliální buňky lemující alveoly a kanály a vřetenové a hvězdicové intersticiální pohyblivé buňky, které leží v intersticiálním prostoru, kde mohou být uspořádány do hnízd. Myoepiteliální markery, jako jsou p63, CK5/6, CK14, Alfa-SMA, a VIM, dokázal být cenné diagnostické doplňky k usnadnění hodnocení složité a smíšené proliferace. CK19 je považován za zlatý standardní marker luminálního epitelu a byl použit k zabránění nesprávné diagnóze myoepiteliálních buněk. Protože cross-reaktivita vzory a skutečnost, že lesional ložiska jsou typicky minutu, žádný z myoepiteliální markery těšil 100% citlivost a specifičnost pro myoepiteliální buňky. Jako takový, alespoň 2 markery by měly být použity k vyhodnocení daného zaměření .

na Základě našich výsledků, nejlepší marker pro suprabazálních buněk, byl p63 a to zejména v souvislosti s CK14, která byla omezena na vyspělé (bazální) myoepiteliální buňky a v menší míře následuje CK5/6, Alfa-SMA a VIM (Obrázek 1). CK5/6 však také označil luminální epiteliální buňky, což ztěžovalo jejich odlišení od proliferativních suprabazálních myoepiteliálních buněk . Morfologicky mohou mít epiteliální i myoepiteliální buňky polygonální tvar. Charakteristické pro oba CK14 a CK5/6, ale ne z p63, Alfa-SMA, a VIM, byla jejich snížená exprese v myoepiteliální buňky v suprabazálních proliferační státu. CK14, CK5/6, a p63 výraz se postupně ztratil v buňkách v vřeteno a hvězdicovité pohyblivých státu.

alfa-SMA a VIM byly přítomny ve vřetenovitých myoepiteliálních buňkách s různým stupněm intenzity. Pouze VIM se ukázal jako konzistentní marker pro stelátové pohyblivé myoepiteliální buňky. V této studii byl hvězdicový pohyblivý myoepitel uspořádán do hnízd a lemován klidovými buňkami pravděpodobně alveolárního původu. Tato funkce může podporovat myšlenku, že hnízda hvězdicovité pohyblivých myoepiteliální buňky, které ztratily vyjádření hlavní myoepiteliální suprabazálních značky, ale udržel afinitu pro VIM, jsou prekurzory chrupavky, což naznačuje, že tyto buňky mají úspěšně absolvováno jejich transformace do mezenchymálních elementů. V benigní a maligní myoepiteliální nádory, VIM označování ve všech případech, ztráta všech ostatních suprabazálních myoepiteliální markery, a mizivou pozitivity na CK14 v vřetenité buňky byly svědčí o převažující výraz myoepithelium pohyblivých státu a možný průchod od jednoduchých myoepiteliální buňky mezenchymální fibroblastů.

V naší studii, důkazy o myoepiteliální buňky přesouvá na mezenchymální fenotyp, který se projevil ve ztrátě CK14, CK5/6, a p63 výraz, byl posílen nesouvislé označování vřeteno buněk pro Α-SMA, marker obou myoepiteliálních buněk a myofibroblastů, který byl úplně ztracen v stellate pohyblivých buněk, které mají údajně stát fibroblastů.

další potvrzovací studie Tsuda et al. hlásil výskyt myofibroblastů se zbytky exprese CK14 (popsané jako „převedené myoepiteliální buňky“). V případech zkoumaných v této studii CK14 postupně vybledl, což naznačuje ztrátu (myo-)epiteliálního fenotypu. Tyto výsledky podporují EMT hypotéza zahrnující myoepiteliální, jako stát , který prochází myoepiteliální mezenchymální přechod (MMT). Tato hypotéza byla u psa potvrzena Gärtnerem a kol. who uvedla, že u nádorů prsu jeden z kroků ve vývoji mezenchymálních buněk zahrnuje expresi typických myoepiteliálních znaků.

zajímavý výsledek této studie byl pozitivity pro ER nalezené v 12/29 suprabazálních myoepiteliální buňky a 9/29 hvězdicovité buňky karcinomu v benigní-smíšené nádory a komplexní karcinomů. Dvě izoformy ER receptory byly popsány, a sice, ER-α a ER-β, která je jedinou formou vyjádřil v jádrech izolovaných bazální-myoepiteliální buňky . Protilátka použitá v tomto výzkumu byla zahrnující obě izoformy: luminální i bazální/hvězdicové buňky byly značeny, pravděpodobně luminální buňky ER-α a bazální/hvězdicové buňky ER-β.

Na závěr, suprabazálních myoepiteliální buňky byly dobře charakterizovány p63 a CK14 a v menší míře tím, že ostatní značky používají. Pohyblivé myoepiteliální buňky jsou místo toho charakterizovány alfa-SMA a VIM a ztrátou CK14, CK5/6 a p63 (Obrázek 2). Současné studie také prokázaly, ER jak v luminální epitelu a suprabazálních/hvězdicovité myoepiteliální buňky (ta se asi v polovině případů), a že ER exprese není ovlivněna odpočívá/pohyblivé fázi. Proto se v sériové nebo multistained oddíly, imunohistochemie na POHOTOVOST v kombinaci s p63 a CK14 může sloužit, aby se zabránilo chybné identifikaci luminální nebo myoepiteliální buňky v psí nádorů mléčné žlázy. Trend zachován Alfa-SMA a VIM výraz v vřetenité buňky, a jen VIM pozitivity v stellate pohyblivých buněk, stejně jako se snížil p63 výraz v obou pohyblivých typů, podporuje hypotézu EMT zahrnující myoepiteliální, jako stát v MMT. Pohyblivá buňka vřetena by mohla být považována za dřívější transformaci než hvězdicová buňka směrem k mezenchymálnímu fenotypu.

příspěvek autorů

tito autoři přispěli k této práci stejně.

střet zájmů

autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

poděkování

autoři děkují paní Anne Collinsové za úpravu anglického textu.

doplňkové materiály