Výsledky

studovali Jsme wild-type (WT), heterozygotní V2RV31R/WT, a homozygotní V2R31R/V2R31R myši. Mutantní myši měly normální počet a frekvence zralých splenických αβ T buněk a tymocytů v každém vývojovém stádiu. Vzhledem k nedostatku kongenních markerů nemohou být proteiny TCRß identifikovány alelou, která je kóduje, ani zda zahrnují oblasti Cß1 versus cß2. Proto jsme provedli průtokovou cytometrii pomocí protilátek anti-V2 a anti-V31 pro kvantifikaci buněk exprimujících proteiny V2+ a V31+ TCRß. Jsme testovány CD4+ a CD8+ single-pozitivní (SP) thymocytů, jak jsou zralé a naivní αβ T buněk. Odráží publikovaných dat (8, 9), jsme zaznamenali malý zlomek (0.11%) buněk, které obarví obou protilátek u WT myší (Obr. 1 B A C), což odpovídá malé populaci V2+V31+ αβ T buněk. U myší V2R31R/WT jsme pozorovali 12,4-násobné zvýšení frakce těchto buněk a 32,8-násobné zvýšení u myší v2r31r / V2R31R (obr. 1 B A C). Tyto zvýšené Frekvence dual-tcrß + buněk odpovídaly většímu využití V2 a V31 ve vyjádřených řetězcích TCRß (obr. 1 D-F). Tato data ukazují, že zvýšení kvality RSS dvou Vß na stejné alele zvyšuje jejich přeskupení a následně frakci T buněk exprimujících dva odlišné typy proteinů tcrß. Jako Vß repertoár SP thymocytů odráží relativní úrovní, které jednotlivé Vß segmentů rekombinují (10), přednostní využití V31 nad V2 ukazuje, že V31R outcompetes příponou v2r pro přeskupení. To by mohlo být způsobeno větší dostupností V31 (11) nebo interakcí V31 se segmenty Dß–Jß před místy kontrakce lokusu Tcrß V2 poblíž segmentů Dß–Jß. Zejména vyšší než dvojnásobný nárůst těchto dual-TCRß+ buněk v V2R31R/V2R31R myší ve srovnání s V2R31R/WT myší znamená, že dvě odlišné V(D)Jß přestavby může přispět k TCRß výraz ze stejné alely.

určit, zda jeden TCRß alela může skutečně podpořit vyjádření TCRß bílkoviny ze dvou různých V(D)Jß přestavby, jsme analyzovali myši, kde jeden TCRß alela je inaktivován vypuštění TCRß enhancer (Eß) (12, 13). Jsme testovány myši nesoucí Eß-odstraněny alela naproti WT alely, alela s RSS výměna buď V2 (s příponou v2r) nebo V31 (V31R), nebo obojí (8). Zjistili jsme malé procento (0, 094%) Tymocytů V2+V31+ SP u myší WT/EβΔ (obr. 2 A A B), potenciálně představující vzácnou populaci buněk exprimujících dva různé proteiny TCRß ze stejné alely WT. Bez ohledu na to, jsme pozorovali V2+V31+ buněk na 1,9-krát větší frekvencí v příponou v2r/EβΔ myší a na 4,8-krát větší frekvencí v V31R/EβΔ myší (Obr. 2 A A B). Zvýšení kvality obou Vß RSS tedy zvyšuje frakci buněk exprimujících proteiny V2+ i V31+ TCRß. Zejména jsme zjistili 14, 4krát zvýšenou frekvenci buněk V2+V31 + u myší v2rv31r / EβΔ vzhledem k myším WT / EβΔ (obr. 2 a, B), což naznačuje, že zlepšení kvality dvou Vß RSSs synergicky zvyšuje procento buněk exprimujících oba V2+ a V31+ TCRß proteiny. Odstranění části RSS V31 na alele V2R (alela V2R31Δ; obr. 2C) dramaticky snižuje frekvenci buněk V2+V31+ na úrovně, které jsou ekvivalentní nebo nižší než u myší V2R/EβΔ (0,178% oproti 0,135%; obr. 2 A A B). Souhrnně tato data potvrzují, že alela V2R31R podporuje expresi dvou odlišných proteinů TCRß ze dvou různých přeskupení V (D)Jß na jedné alele.

naše studie ukazuje, že vnitřní genetický mechanismus řídí monogenní tcrß shromáždění a expresi. Ukazujeme, že nekvalitní Vß RSS spolupracují na omezení shromažďování a exprese dvou odlišných tcrß genů z jedné alely. Dříve jsme ukázali, že nekvalitní Vß RSSs stochasticky omezují frekvenci rekombinace Vß před inhibicí zpětné vazby ke snížení bialelické sestavy a exprese tcrß genů (8). Jsme nyní dále k závěru, že low-kvalitní Vß RSSs také nižší incidence, že oba V31 a těžební Vß rekombinují na stejné alely. Tyto přestavby by mohla zahrnovat 1) deletional V2 přeskupení na Dß1–Jß1–Cß1 clusteru a inversional V31 přeskupení na Dß2–Jß2–Cß2 clusteru, nebo 2) inversional V31 přeskupení na Dß1–Jß1–Cß1 clusteru, který invertuje část locus, který obsahuje Dß2–Jß2–Cß2 clusteru, a pak inversional V2 přeskupení na Dß2–Jß2–Cß2 clusteru (7) (Obr. 2D). K dosažení monogenních TCRß shromažďování a projevu, tyto RSS-based genetický mechanismus by mohl fungovat s epigenetické procesy, které byly zapojeny do prosazování monoallelic Vß rekombinace. Například, bylo navrženo, že dynamická interakce Vß segmentů s jadernou laminou snižuje Vß rekombinace účinnosti tím, že potlačují Vß přístupnost chromatinu a chromozomů opakování mezi Dß–Jß klastrů a proti proudu Vß segmentů (14, 15). V této souvislosti, nekvalitní Vß RSSs by mohlo snížit pravděpodobnost, že dva Vß přestavby se vyskytují na alela když V31 a těžební Vß segmentů jsou i přístupné a proti proudu Vß je ovinutý v blízkosti s Dß–Jß segmenty. Vlastnosti RSSs tedy mohou být základem monogenního shromáždění a exprese savčích tcry, tcrδ a Igλ proteinů u savců a IG proteinů v chrupavčitých rybách. Navíc V RSS mohou podobně přispívat k izotypové exkluzi Igk a Igλ v B buňkách.