Aktivace RNase H

RNase H je všudypřítomný enzym, který degraduje RNA z RNA–DNA duplexu. Byl identifikován v organismech tak rozmanitých jako viry a lidské buňky (Crouch a Dirksen, 1985). V eukaryotických buňkách byly identifikovány nejméně dvě třídy Rnázy H. U prokaryot bylo pozorováno více enzymů s aktivitou Rnázy H (Crouch a Dirksen, 1985). Ačkoli se Rnáza H podílí na replikaci DNA, může hrát jiné role v buňce a Nachází se v cytoplazmě, stejně jako v jádru (Crum et al., 1988). Předpokládá se však, že koncentrace enzymu v jádru je větší a některé enzymy nalezené v cytoplazmatických preparátech mohou být způsobeny jaderným únikem.

přesné rozpoznávací prvky pro Rnázu H nejsou známy. Ukázalo se však, že oligonukleotidy s vlastnostmi podobnými DNA, tak krátké jako tetramery, mohou aktivovat Rnázu H (Donis-Keller, 1979). Změny v cukru vliv RNase H aktivace jako cukr změny, které v důsledku RNA-jako oligonukleotidy, například 2′-fluoro nebo 2′-methoxy nezdá se, sloužit jako substráty pro RNase H (Sproat et al., 1989; Kawasaki a kol., 1993). Změny v orientaci cukru, k základně může také ovlivnit RNase H aktivace jako α-oligonukleotidy jsou schopny vyvolat RNase H nebo mohou vyžadovat paralelní žíhání (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Navíc páteřní modifikace ovlivňují schopnost oligonukleotidů aktivovat Rnázu h. Methylfosfonáty neaktivují Rnázu H (Maher et al ., 1989; Miller, 1989). Naproti tomu fosforečnany jsou vynikajícími substráty (Cazenave et al., 1989; Mirabelli a kol., 1991; Stein a Cheng, 1993). Kromě toho byly chimérické molekuly studovány jako oligonukleotidy, které se vážou na RNA a aktivují Rnázu H (Furdon et al ., 1989; Quartin et al., 1989). Například, oligonukleotidy skládá z křídla 2′-methoxy fosfonáty a pěti-základní mezera deoxyoligonucleotides vázat na jejich cílové RNA a aktivovat RNase H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Kromě toho, jeden ribonukleotid v pořadí deoxyribonukleotidy bylo prokázáno, že být dostatečná, aby mohla sloužit jako podklad pro RNase H když se váže k jeho komplementární deoxy-oligonukleotid (Eder a Walder, 1991).

Že je možné využít chimerická oligonukleotidy navrženy tak, aby aktivovat RNase H a mají vyšší afinitu pro jejich RNA receptory a zvýšit specifičnost byla také prokázána (Giles a Tidd, 1992; Monia et al., 1993). V jedné studii, RNase H-zprostředkované štěpení cílové přepis byl mnohem více selektivní při deoxyoligonucleotides skládá z methylfosfonát deoxyoligonucleotide křídla a phosphodiester mezery byly ve srovnání s plnou phosphodiester oligonukleotidy (Giles a Tidd, 1992).

i Přes informace o RNase H a ukázka toho, že mnoho oligonukleotidy mohou aktivovat RNase H v lyzátu a purifikované enzymové testy, relativně málo je zatím známo o roli strukturálních rysů v RNA cíle v aktivaci RNase H (Minshull a Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Waldera a Waldera, 1988). Ve skutečnosti přímý důkaz, že aktivace Rnázy H je ve skutečnosti mechanismem působení oligonukleotidů v buňkách, až donedávna chyběl.

nedávné studie v našich laboratořích poskytují další, i když nepřímé, vhled do těchto otázek. ISIS 1939 je 20 mer fosforothioát komplementární k sekvenci v 3′ – netranslated oblasti ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Inhibuje produkci ICAM v endotelových buňkách lidské pupeční žíly a Severní bloty ukazují, že mRNA ICAM-1 je rychle degradována. 2′-methoxy analogové ISIS 1939 zobrazuje vyšší afinitu k RNA než phosphorothioate, je stabilní v buňky, ale inhibuje ICAM-1 produkci bílkovin mnohem méně silně než ISIS 1939. Je pravděpodobné, že ISIS 1939 destabilizuje RNA a aktivuje RNase H. V kontrastu, ISIS 1570, 18-mer phosphorothioate, která je komplementární k překladu zahájení kodonu z ICAM-1 zpráva inhibuje produkci proteinu, ale způsobil žádné degradaci RNA. Tak, dva oligonukleotidy, které jsou schopné aktivovat RNase H měl různé účinky v závislosti na místě v mRNA, na níž je vázán (Chiang et al., 1991). Více přímá ukázka toho, že RNase H je pravděpodobné, že klíčovým faktorem v činnosti mnoha antisense oligonukleotid byla poskytována studií, ve kterých reverse-ligace PCR byl použit k identifikaci produktů štěpení z bcrabl mRNA v buňkách léčených phosphorothioate oligonukleotidy (Crooke et al., 1995).

Vzhledem k rozvíjející se roli chimerická oligonukleotidů s modifikací v 3′- a 5′-křídla navrženy tak, aby zvýšit afinitu k cílové RNA a nuclease stabilitu a DNA-typ mezery sloužit jako podklad pro RNase H, studie zaměřené na pochopení dopadů různých změn na účinnost enzymu(y), jsou také značný význam. V jedné takové studii E. coli Rnázy H jsme uvedli, že enzym vykazuje minimální sekvenční specificitu a je procesivní. Když byl chimérický oligonukleotid s 2′- modifikovanými cukry v křídlech hybridizován s RNA, počátečním místem štěpení byl nukleotid přiléhající k methoxy-deoxy křižovatce nejblíže 3 ‚ – konci substrátu RNA. Počáteční rychlost štěpení zvyšuje i velikost DNA mezera zvýšil a účinnost enzymu bylo podstatně méně proti RNA cíl duplexed s chimérická antisense oligonukleotid než plné DNA-typ oligonukleotid (Crooke et al., 1995).

V následných studiích, zhodnotili jsme působení antisense oligonukleotidy s strukturovaných a nestrukturovaných cíle a dopady těchto interakcí na RNase H podrobněji (Lima a Crooke, 1997). Pomocí řady neštěpitelných substrátů a analýz Michaelis-Menten jsme byli schopni vyhodnotit vazbu i štěpení. Ukázali jsme, že ve skutečnosti je E.coli Rnáza H1 dvojvláknový protein vázající RNA. KD pro duplex RNA byl 1,6 µM; Kd pro duplex DNA byl 176 µM; a Kd pro jednovláknovou DNA byl 942 µM. Naproti tomu enzym mohl štěpit RNA pouze v duplexu RNA-DNA. Jakákoli 2 ‚- modifikace antisense léčiva v místě štěpení inhibovala štěpení, ale významné snížení náboje a 2 ‚ – modifikace byly tolerovány v místě vazby. Nakonec umístění kladného náboje (např. 2‘-propoxyamin) do antisense léčiva snížilo afinitu a štěpení. Zkoumali jsme také účinky RNA struktur indukovaných antisense oligonukleotidy na aktivitu E. coli Rnázy H1 (Lima a Crooke, 1997). Bylo zjištěno, že jakákoli struktura v duplexním substrátu má významný negativní vliv na rychlost štěpení. Dále, štěpení vybraných lokalit byla zcela inhibována, a to bylo vysvětleno tím, stérické překážky uložené RNA smyčky křížení buď menší či větší rýhy nebo heteroduplexu. Nedávno jsme klonovali a exprimovali lidskou Rnázu H1. Protein je homologní s E. coli Rnázou H1, ale má vlastnosti podobné těm, které jsou popsány pro lidskou Rnázu H typu 2 (Frank et al ., 1994; Wu a kol., 1998). Enzym je stimulován nízkými koncentracemi Mg2+, inhibován vyššími koncentracemi a je inhibován Mn2+ v přítomnosti Mg2+. Má molekulovou hmotnost 33 kDa. Jedná se o dvouvláknový protein vázající RNA a vykazuje jedinečné polohové a sekvenční preference pro štěpení (Wu et al ., 1999). Navíc byla klonována lidská Rnáza H2, ale dosud nebylo prokázáno, že exprimovaný protein je aktivní (Frank et al., 1998). Velmi nedávno jsme informovali o účincích několika mutací zavedených do lidské Rnázy H1 na aktivitu enzymu (Wu et al ., 2000). Nyní tedy máme potřebné nástroje, abychom mohli začít zkoumat role lidské Rnázy H v biologických a farmakologických procesech a začít vyvíjet léky určené k efektivnější interakci s nimi.

a Konečně, alespoň s ohledem na RNase H-indukované degradace cílové RNA, jsme v poslední době prokázaly, že v rozmezí 1-150 kopií RNA na buňku, úroveň cílové RNA, nemá vliv na potenci antisense inhibitory (Miraglia, 2000). To je způsobeno skutečností,že počet molekul antisense léčiva na buňku překračuje počet kopií RNA o několik řádů. Tím pádem, další faktory musí být omezení rychlosti.