Aptamery se objevily jako nová kategorie v oblasti bioreceptorů kvůli jejich širokým aplikacím od biosenzování po terapeutika. Bylo hlášeno několik variant jejich screeningového procesu, nazývaného SELEX, který může poskytnout sekvence s požadovanými vlastnostmi potřebnými pro jejich konečné použití.

Generování single pletl oligonukleotid libraryEdit

první krok SELEX zahrnuje syntézu plně nebo částečně randomizovaná oligonukleotidovou sekvencí některých délce lemován definovanými regiony, které umožňují amplifikaci PCR z těch randomizované regionů, a v případě RNA SELEX, in vitro transkripce randomizované sekvencí. Zatímco Ellington and Szostak prokázáno, že chemická syntéza je schopen generovat ~1015 unikátní sekvence oligonukleotidových knihoven v jejich 1990 papír na in vitro výběr, zjistili, že zesílení těchto syntetizovaných oligonukleotidů vedla k významné ztrátě bazén, rozmanitost vzhledem k PCR zkreslení a vady v syntetizovaných fragmentů. Na oligonukleotid bazén je zesílen a dostatečné množství původní knihovna je přidán do reakce tak, že tam jsou četné kopie každé jednotlivé sekvence, aby se minimalizovalo ztráty potenciální vazebné sekvence v důsledku náhodné události. Před knihovnou je představen cíl pro inkubaci a selektivní retence, sekvence knihovna musí být převedeny na jednovláknových oligonukleotidů k dosažení strukturální konformací s cílovou vazebné vlastnosti.

Cíle incubationEdit

těsně před cíl, úvod, single pletl oligonukleotid knihovna je často zahřívá a ochladí se pomalu renature oligonukleotidů do termodynamicky stabilní sekundární a terciární struktury. Po přípravě se randomizovaná knihovna inkubuje s imobilizovaným cílem, aby se umožnila vazba oligonukleotid-cíl. Existuje několik důvodů pro tuto cílovou inkubační krok, včetně cílové imobilizace metody a strategie pro následné nevázaného oligonukleotid oddělení, inkubační doby a teploty, inkubační pufr podmínky a cíle versus oligonukleotid koncentrace. Příklady metod imobilizace cíle zahrnují afinitní chromatografické kolony, filtry pro vazbu nitrocelulózy a paramagnetické kuličky. Nedávno byly vyvinuty SELEXOVÉ reakce, kde cílem jsou celé buňky, které jsou expandovány v blízkosti úplného soutoku a inkubovány s oligonukleotidovou knihovnou na kultivačních deskách. Podmínky inkubačního pufru se mění na základě zamýšleného cíle a požadované funkce vybraného aptameru. Například, v případě, že negativně nabité malé molekuly a proteiny, vysoce soli, pufry se používají pro nabíjení screening umožní nukleotidů přístupu k cíli a zvýšit šanci na konkrétní závazné události. Alternativně, pokud je to žádoucí aptamer funkce je in vivo bílkovin nebo celé buňky závazné pro potenciální terapeutické nebo diagnostické aplikace, inkubační pufr podobných podmínek in vivo plazmatické koncentrace solí a homeostatické teploty jsou více pravděpodobné, že generovat aptamers, že může vázat in vivo. Dalším hlediskem v podmínkách inkubační vyrovnávací paměti jsou nespecifičtí konkurenti. Pokud existuje vysoká pravděpodobnost, že non-specifických oligonukleotidových uchovávání v reakční podmínky, nespecifické konkurentů, což jsou malé molekuly, nebo polymery jinými než SELEX knihovny, které mají podobné fyzikální vlastnosti, aby knihovna oligonukleotidy, mohou být použity obsadit tyto nespecifická vazebná místa. Změna relativní koncentrace cílových a oligonukleotidů může také ovlivnit vlastnosti vybraných aptamerů. Pokud dobrá vazebná afinita k vybranému aptameru není problémem, lze použít přebytek cíle ke zvýšení pravděpodobnosti, že se alespoň některé sekvence během inkubace navážou a zůstanou zachovány. Nicméně, to poskytuje žádnou selektivní tlak pro vysokou vazebnou afinitu, což vyžaduje oligonukleotid knihovna bude v přebytku tak, že tam je konkurence mezi unikátní sekvence pro k dispozici specifická vazebná místa.

Závazné pořadí eluce a amplificationEdit

Jakmile oligonukleotid knihovny byl inkubován s cílovou dostatek času, bez závazků oligonukleotidy jsou odplaveny z znehybní cíl, často pomocí inkubační pufr tak, aby specificky váže oligonukleotidy jsou zachovány. S nevázané sekvence odplaveny, specificky váže sekvence jsou pak eluovány vytvořením denaturace podmínky, které podporují oligonukleotid rozvinutí či ztrátě vazebné konformace včetně tekoucí v deionizované vodě, pomocí denaturace roztoky obsahující močovinu a EDTA, nebo za použití vysoké teploty a fyzické síly. Po eluci vázaných sekvencí, udržel oligonukleotidy jsou zpětně přepsána do DNA, v případě RNA nebo upravené základní výběry, nebo jednoduše shromažďovány pro zesílení, v případě DNA SELEX. Tyto DNA šablony z eluovány sekvence jsou pak amplifikovány pomocí PCR a převést na single pletl DNA, RNA, nebo modifikované base oligonukleotidy, které jsou použity jako počáteční vstup pro další kolo výběru.

získání ssDNAEdit

jedním z nejkritičtějších kroků v proceduře SELEX je získání jednovláknové DNA (ssDNA) po kroku amplifikace PCR. To bude sloužit jako vstup pro další cyklus, takže je životně důležité, aby veškerá DNA byla jednovláknová a co nejméně se ztratila. Vzhledem k relativní jednoduchosti, jedna z nejvíce používaných metod je použití biotinylated reverzní primery na amplifikaci krok, po kterém komplementární prameny mohou být vázán na pryskyřici, následuje eluce druhého vlákna s louhem. Další metodou je asymetrické PCR, kde amplifikační krok se provádí s přebytkem forward primer a velmi malý zpětný primer, což vede k produkci více požadovaný pramen. Nevýhodou této metody je, že produkt by měl být čištěn z dvouvláknové DNA (dsDNA) a jiného zbývajícího materiálu z PCR reakce. Enzymatické degradace nežádoucí pramen může být provedeno tím, že označování této oblasti pomocí fosfát-sondoval primer, jako je uznán enzymy, jako jsou Lambda exonuclease. Tyto enzymy se pak selektivně snížit fosfát tagged pramen opuštění komplementární vlákno neporušené. Všechny tyto metody obnovují přibližně 50 až 70% DNA. Podrobné srovnání najdete v článku Svobodové a kol. kde jsou tyto a další metody experimentálně porovnávány. V klasické SELEX, proces randomizované jeden pletl, knihovna generace, cíl inkubace, a závazné pořadí eluce a zesílení popsáno výše, se opakují, dokud drtivá většina udržel bazén se skládá z cílové vazebné sekvence, i když tam jsou změny a dodatky k postupu, které jsou často používány, které jsou popsány níže.

Negativní nebo proti selectionEdit

V zájmu zvýšení specifičnosti aptamers vybrané daným SELEX postup, negativní výběr, nebo proti výběru kroku mohou být přidány před nebo bezprostředně následující cílové inkubace. K odstranění sekvence s afinitu k cílové imobilizace složek matrice z bazénu, negativní výběr lze použít tam, kde knihovna je inkubovány s cílem imobilizace složek matrice a nenavázané sekvence jsou zachovány. Negativní selekce může být také použit k odstranění sekvence, které se vážou cíl-jako molekuly nebo buňky inkubací oligonukleotid knihovna s malé cílové molekuly analogů, nežádoucí typy buněk, nebo non-cílové proteiny a zachování nevázaného sekvence.

Sledování výběr progressionEdit

sledovat průběh SELEX reakce, počet cílových vázané molekuly, což je ekvivalentní počtu oligonukleotidů vymývá, může být v porovnání s odhadovanou celkovou vstup oligonukleotidů následující eluční v každém kole. Počet eluovaných oligonukleotidů lze odhadnout pomocí odhadů koncentrace eluce pomocí absorbance vlnové délky 260 nm nebo fluorescenčního značení oligonukleotidů. Jako SELEX reakce přístupy dokončení, zlomek oligonukleotid knihovna, která se váže cíl blíží 100%, tak, že počet molekuly eluovány přístupy celkové oligonukleotid vstupní odhad, ale může se sbíhají na nižší číslo.

upozornění a úvahyedit

některé SELEXOVÉ reakce mohou generovat sondy, které jsou závislé na oblastech vazby primeru pro tvorbu sekundární struktury. Existují aplikace aptameru, pro které je žádoucí krátká sekvence, a tedy zkrácení primeru. Postup na původní metoda umožňuje RNA knihovna vynechat konstantní primer regionů, což může být obtížné odstranit po výběru procesu, protože oni stabilizace sekundární struktury, které jsou nestabilní, když tvoří náhodný region sám.