ekstracellulær matrice forberedelse og reologi

ECM består af et netværk af gelatine og fibrin. Til fremstilling af ECM-komponenterne fremstilles først en 15 vægt/v% gelatineopløsning (Type A, 300 Flor fra svineskind, Sigma) ved tilsætning af gelatinepulver til en varm opløsning (70 kg c) DPBS (1 gang dulbelcos fosfatbufrede saltvand uden calcium og magnesium). Gelatinen får lov til at opløses fuldstændigt ved omrøring i 12 timer ved 70 liter C, og pH justeres derefter til 7,5 under anvendelse af 1 M NaOH. Opløsningen er steril filtreret og opbevaret ved 4 liter C i alikvoter til senere brug i støbning (<3 måneder). En fibrinogenopløsning (50 mg/mL) fremstilles ved opløsning af lyofiliseret bovint blodplasmaprotein (Millipore) ved 37 liter C i sterile DPB ‘ er uden calcium og magnesium. Opløsningen holdes ved 37 liter C uden omrøring i mindst 45 minutter for at tillade fuldstændig opløsning. Transglutaminase (TG) – opløsningen (60 mg/mL) fremstilles ved opløsning af lyofiliseret pulver (Moo Gloo) i DPB ‘ er uden calcium og magnesium og blandes forsigtigt i 20 sek. opløsningen holdes derefter ved 37 liter C i 20 minutter og sterilt filtreret inden brug. En CaCl2 stamopløsning (250 mM) fremstilles ved at opløse CaCl2 pulver i DPB ‘ er uden calcium og magnesium (Corning). Til fremstilling af stamopløsning af thrombin rekonstitueres lyofiliseret thrombin (Sigma Aldrich) ved 500 U/mL ved anvendelse af sterile DPB ‘ er og opbevares ved -20 liter C. trombin alikvoter optøes umiddelbart før brug.

et kontrolleret spændingsreometer (DHR-3, Ta-instrumenter, nyt slot, de) med en diameter på 40 mm, 2 liter kegle og pladegeometri bruges til målinger af blækreologi. Forskydningslagringsmodulerne (G’) og tabsmodulerne (G”) måles med en frekvens på 1 HS og en oscillerende stamme (liter) på 0,01. Tidsfejninger udføres ved hurtigt at placere en forblandet ECM-opløsning, der indeholder thrombin, på Peltier-pladen, der holdes ved 37 liter C.

Blækformuleringer

Der kræves to blæk til 3D-bioprinting af perfusable PT-modeller. Et blæk, der bruges til at skabe perfusionschippakningen, består af en todelt silikoneelastomer (SE 1700, FØRKEMIKALIE) med en 10:1 base til katalysator (efter vægt), der homogeniseres ved hjælp af en centrifugalblander i 2 minutter (2000 o / min, AE-310, Thinky Corp, Japan). Silikoneblækket udskrives inden for 2 timer efter blanding med katalysator. Dette blæk lægges i en sprøjte (EFD Inc., East Providence, RI) og centrifugeret for at fjerne eventuelle luftbobler før udskrivning ved stuetemperatur. Det andet blæk, et flygtigt blæk, der bruges til at udskrive tubulen, består af 38 vægt% Pluronisk F127 (Sigma) og 100 U/mL thrombin i deioniseret, ultrafiltreret (DIUF) vand. Det flygtige blæk farves lyserødt ved tilsætning af et Risikoreaktorfarvestof til visualisering i Fig. 1 og film S1. Til fremstilling af dette blæk homogeniseres en 40 vægt% Pluronisk f127-opløsning i vand under anvendelse af en Tyndblander, indtil pulveret er helt opløst og derefter opbevaret ved 4 liter C. Før brug tilsættes en 2000 U/mL thrombinopløsning til det flygtige (Pluroniske) blæk i et forhold på 1:20 og homogeniseres under anvendelse af en Tyndblander. Den flygtige blæk lægges derefter i en sprøjte (EFD Inc., East Providence, RI) ved 4 liter C og centrifugeret for at fjerne eventuelle luftbobler. Før udskrivning er dette blæk ækvilibreret ved stuetemperatur i mindst 15 minutter.

Bioprinting af perfusable 3D proksimale tubulekonstruktioner

3D PT-konstruktioner fremstilles ved hjælp af en specialdesignet, multimaterial 3D bioprinter udstyret med fire uafhængigt adresserbare skrivehoveder monteret på en 3-akset, bevægelsesstyret portalkran med et byggevolumen på 725 mm l 650 mm l 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Blæk er anbragt i separate sprøjtetønder, hvortil dyser af forskellig størrelse (dvs.50 liter–410 liter diameter) er fastgjort via en luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Blæk ekstruderes gennem aflejringsdyser ved at anvende lufttryk (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, USA), der spænder fra 10-90 psi, svarende til udskrivningshastigheder mellem 1 mm/s og 5 cm/s. vi udskriver først den tilpassede perfusionspakningspakning ved at deponere silikoneblækket gennem en tilspidset 410 liter dyse på 50 mm liter 75 mm glasrutschebaner. Pakningsdesignet oprettes ved hjælp af et brugerdefineret MATLAB-script, der genererer G-kode til en endelig pakningsstruktur. Efter udskrivning hærdes perfusionschippakningen ved 80 liter C i en ovn til >1 time og opbevares ved stuetemperatur inden brug.

mønster 3D PTs inden for perfusion chip kræver en kombination af støbning af ECM og udskrivning af fugitive blæk. For det første oprettes ECM-opløsningen ved at kombinere 10 mg/mL fibrinogen, 7,5 vægt% gelatine, 2,5 mM CaCl2 og 0,2 vægt% TG. Denne opløsning ækvilibreres derefter ved 37 liter C i 15-20 minutter før brug for at forbedre den optiske klarhed i ECM25. Derefter blandes opløsningen hurtigt med thrombin i et forhold på 500:1, hvilket resulterer i en endelig trombinkoncentration på 1 U/mL. Inden for 2 minutter ved 37 liter C følger polymerisering af fibrinogen til fibringel. Af denne grund skal ECM-opløsningen støbes på bunden af perfusionschippen umiddelbart efter blanding med thrombin. Basis ECM-laget får derefter lov til at tørre lidt under nitrogen, således at det danner en flad overflade. Det flygtige Pluroniske f127-blæk (med 100 U/mL thrombin) er trykt på basis ECM-laget i form af et indviklet filmament (tubule) ved hjælp af en tilspidset 200 liter dyse. Et brugerdefineret Python-script (MeCode) bruges til at specificere værktøjsstien i G-kode. Direkte efter flygtig blækudskrivning bringes metalhule perfusionstifter, der er forbundet gennem silikonepakningen, i kontakt med det trykte blæk. Et øverste lag ECM dannes derefter ved at støbe ECM-opløsningen over det trykte rør, som beskrevet ovenfor, til inden for 1-2 mm af pakningsvæggenes højde. Hvis celler, såsom Hndf ‘ er, er inkorporeret i ECM (Fig. S5), blandes de ind umiddelbart efter ækvilibreringsperioden, før thrombinblanding og efterfølgende støbning. Efter at det øverste ECM-lag er støbt, er konstruktionen dækket med et glasskinne for at forhindre fordampning eller kontaminering og holdes ved 37 liter C i 1 h for at tillade fibrinpolymerisering at afslutte og TG for at tværbinde netværket. Konstruktionen afkøles derefter til 4 liter C i 15-20 minutter for at flydende det trykte Flygtige blæk, der skylles ud af enheden ved hjælp af koldcellemedier og efterlader åbne ledninger, der tjener som det ønskede rørformede netværk indlejret i ECM med eller uden celler i det ekstratubulære ECM-rum.

ved hjælp af denne metode producerede vi også 3D-arkitekturer i en lag-for-lag-byggesekvens. For eksempel er hvert enkelt lag af trelagsstrukturen vist i Fig. S10 er konstrueret ved hjælp af en modificeret udskrivningsprotokol, der inkorporerer de tidligere diskuterede materialer og metoder. Efter udskrivning af de første tubuli med flygtig blæk, et lag ECM støbes over udskriften og tillades 20 min til gel ved 37 liter C, før det næste proksimale tubulelag udskrives med flygtig blæk oven på det nyligt gelerede lag. Denne successive konstruktion introducerer 3D-geometri og muliggør en vellykket evakuering af alle kanaler uafhængigt efter konstruktion. Vandbaserede risikoreaktorfarvestoffer perfunderes gennem kanalerne og ophidses med UV-lys til visualisering.

for at fuldføre 3D-vævschipsamlingsprocessen placeres hver PT-konstruktion på en bearbejdet rustfri stålbase, og et tykt akryllåg placeres ovenpå. Låget og bunden er fastspændt sammen med fire skruer, der danner en tætning omkring den trykte silikonepakning. Dernæst er steril to-stop peristaltisk slange (PharMed BPT, 0,25 mm indvendig diameter) fyldt med medier og forbundet til udløbet af et sterilt filter, der er fastgjort til en 10 ml sprøjtetønde (EFD Nordson), der fungerer som et mediereservoir. Ptec-medier (Designet til vækst, så ATCC-formulering plus 1% FBS, 1% aprotinin og 1% anti-anti), der har været ækvilibrerende for >3 h i en inkubator ved 37 liter C tilsættes 5% CO2 til mediebeholderen, og rør fra reservoiret er forbundet til udløbet af chippen (metalhul perfusionstift). En sprøjte bruges derefter til at udøve let tryk på mediet i tønden, hvilket tvinger det til at komme ind og fylde det vedhæftede rør fuldstændigt. Fyldning af slangen med medier inden tilslutning til kredsløbet forhindrer indføring af luftbobler i systemet. For at fuldføre perfusionskredsløbet er silikoneslanger fra reservoiret forbundet til indløbsmetalperfusionstappen på chippen. Klemklemmer til slanger tilføjes ved indløb og udløb af perfusionschippen for at forhindre ukontrolleret strømning, når den afbrydes fra den peristaltiske pumpe, hvilket kan beskadige epitelet eller tillade luftbobler at komme ind i systemet. Mediereservoiret er til enhver tid ækvilibreret med atmosfæriske forhold i inkubatoren ved hjælp af et sterilt filter oven på mediereservoiret.

cellekultur

menneskelige udødeliggjorte Ptec ‘er (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) dyrkes i henhold til ATCC’ s instruktioner og bruges til alle PT-modelundersøgelser op til passage 20. Til genekspressionsanalyse anvendes og dyrkes humane primære RPTEC (Cellevidenskab), udødelige Ptec ‘ er (Rptec-TERT1, Evercyte) og A498 (ATCC HTB-44) renale cancerceller i henhold til leverandørens instruktioner. Humane neonatale dermale fibroblaster (HNDF), GFP-udtryk (Angio-Proteomie) dyrkes i henhold til leverandørens instruktioner og bruges op til passage 15.

genekspressionsanalyse

Human primær RPTEC (Cellevidenskab), udødeliggjort rptec-TERT1 (Evercyte) og A498 (ATCC HTB-44) nyrecancerceller dyrkes i 96-brøndsplader i henhold til leverandørens instruktioner og indsamles på Dag 3 Efter konfluens ved at erstatte dyrkningsmedium med 100 liter/brønd af 1 RNA-lysis-blanding (Kvantitigenprøvebehandlingssæt, KS0101). Derefter blandes 40 liter lysat med et mRNA-capture magnetisk perlesæt (Panomics Kvantitigenplekssæt 12631, katalognummer 312631), inkuberes natten over, behandles til Forgrenet DNA-amplifikation og analyseres i henhold til producentens anvisninger (Panomics Kvantitigenpleksassagesæt, KP1015). PPIB-sonden bruges som et husholdningsgen til normalisering. Fluorescensintensitetsdata (FI) præsenteres som gennemsnit og standardafvigelse for 3 biologiske replikater.

Cytokinanalyse af medieperfusat

Medieperfusat opsamles fra et tubulat over en periode på 25 dage efter cellesåning og opbevares ved -80 liter C før analyse. Til cytokinprofilering optøes supernatanter på is, fortyndes 2 gange i prøvefortyndingsbuffer (biorad-katalog #M60-009rdpd) og analyseres ved hjælp af Elisa baseret på Lumineks-teknologi ved hjælp af Bio-Pleks Pro-Human Chemokine IL-6 (Sæt #171bk29mr2), IL-8 (Sæt #171-BK31MR2) og MCP-1 (Sæt #171-BK36MR2) og Bio-Pleks 200-systemerne (biorad) i henhold til producentens anvisninger. Data rapporteres som gennemsnitlige cytokinkoncentrationer og standardafvigelser for tekniske triplicater.

epithelialisering og langsgående kultur

hver 3D PT-konstruktion perfunderes i flere timer med PTEC-medier i inkubatoren inden celleindlæsning / såning. Ptec ‘er (PTEC/TERT1, ATCC) trypsiniseres fra deres kulturskål og koncentreres i medier til ~2 liter 107 celler/mL. Cellesuspensionen lægges derefter ind i perfusionschippen gennem udløbet (Fig. S3b, c). Den belastede konstruktion placeres sideværts i inkubatoren i flere timer og vendes 180 liter i løbet af flere halvtimes intervaller for at muliggøre ensartet udsåning af rørvæggene og inkuberes derefter i tubulen uden strømning natten over. Den næste dag skylles ikke-klæbende celler ud af tubulen under strømning af tyngdekraften. Perfusion af friske medier startes derefter, og de resterende celler begynder at klynge sig og vokser derefter fra disse kolonier (Fig. S3f), indtil de når sammenløb omkring 3 uger efter såning (Fig. S3k). I vækstfasen fodres Ptec ‘ er med PTEC-medier udarbejdet i henhold til ATCC-retningslinjer plus 1% aprotinin (EMD Millipore, der bruges til at bremse nedbrydningen af ECM), 1% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotikum-antimykotisk (Gibco). Efter modning fjernes FBS, og Ptec ‘ er pakkes i et tæt epitelmonolag (Film S2). På dag 1 efter såning udsættes Ptec ‘ erne for kontinuerlig, ensrettet strømning ved 1 liter/min, hvilket svarer til forskydningsspændinger, der varierer mellem 0,1 og 0,5 dyner/cm2 afhængigt af tubuletværsnittet. Medier tilføres via en peristaltisk pumpe i et lukket kredsløb og skiftes hver 2.dag.

Albuminoptagelsesstudie

Albuminoptagelse vurderes for de trykte 3D PT-modeller såvel som 2D-kontroller. Den første kontrol består af Ptec ‘er dyrket på vævskulturplast, mens den anden kontrol består af Ptec’ er dyrket på vores ECM. I hvert tilfælde dyrkes Ptec ‘ er til sammenflydelse og får lov til at modnes i serumfrie medier. Humant serumalbumin konjugeret med FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) suspenderes i ptec-medier ved 50 liter/mL. Alle prøver inkuberes med HSA-FITC i deres medier i 2 timer (i tilfælde af perfusion perfunderes den gennem det åbne lumen). Efter eksponering vaskes alle prøver med 3 gange volumen og trypsiniseres derefter med 10 gange trypsin for at opsamle de enkelte celler. Cellerne er faste og modfarvede med primære og sekundære antistoffer mod megalin (tabel S2 viser de specifikke antistoffer, der anvendes). Celler fra disse prøver og nøgne celler analyseres ved strømningscytometri (Bd LSR Fortessa), og data indsamles fra n = 10.000 celler pr. For at få billeder af HSA-FITC og megalin i Ptec ‘ er fastgøres prøver på plads med formalin i stedet for at blive trysiniseret efter vasketrinnet. Disse prøver er modfarvet for megalin og afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi (Seiss LSM710).

cyclosporin en test

virkningen af CysA på både 2D-kontroller og bioprintet 3D PTs undersøges. I 2D podes celler i et 96-brøndformat på vævskulturplast og dyrkes til sammenløb. De er fed media PR ATCC retningslinjer. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) suspenderes i deres medier i forskellige koncentrationer og inkuberes med celler i 24 timer. en levedygtighedsanalyse ved anvendelse af(3-(4,5-dimethylthiasol-2-yl)-5-(3-sulfophenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrasolium) i nærvær af PHENASINMETHOSULFAT (MTS) køres ved 24 h-mærket efter eksponering. Dette assay er afsluttet på Ptec ‘ er ved tidlig sammenløb ved at give CysA til cellerne den dag, de nåede sammenløb, såvel som sen sammenløb ved at give CysA flere dage efter, at de nåede sammenløb. Navnlig er toksicitetsresultaterne ens for hvert tilfælde (Fig. 5n). For 3D PTs fodres CysA i forskellige koncentrationer gennem det åbne lumen af modne tubuli efter at have nået konfluens (ved ~3 ugers mærke), hvor intet serum er inkluderet i medierne i mindst 10 dage. Ved 24-timers-mærket efter CysA-eksponering udføres en FITC-dekstran-lækagetest (beskrevet nedenfor) for at vurdere og kvantificere forstyrrelser i ptec ‘ ernes barrierefunktion. Umiddelbart efter fastgøres PT ved hjælp af 10% bufret formalin i 1 time og modfarvet for actin og DAPI (tabel S2 viser de specifikke anvendte pletter).

Diffusionspermeabilitetsmålinger

for at vurdere barrierefunktionen af epitelet i 3D kvantificeres diffusionspermeabilitet ved at perfusere ptec-medier i det åbne lumen indeholdende 25-Karp/mL FITC-konjugeret 70 kDa dekstran (FITC-dekstran, Sigma produkt 46945) med en hastighed på 15-Karp/min i 3 min og 1-Karp / min derefter i ~30-45 min. Hele testen udføres under levende cellebilleddannelse med både tubulen og den omgivende ECM i synsfeltet (Fig. S9). Diffusionsmønsteret af FITC-deks detekteres ved hjælp af et bredt felt fluorescerende mikroskop (Seiss Aksiovert 40 CFL). Fluorescens billeder er taget før perfusion og hver 3 til 5 min over en 30-45 min periode. Diffusionspermeabilitet beregnes ved at kvantificere ændringer i fluorescensintensitet over tid ved hjælp af følgende ligning34;

Pd er diffusionspermeabilitetskoefficienten, I1 er gennemsnitsintensiteten ved et indledende tidspunkt, I2 er en gennemsnitlig intensitet ved t ~ 30-45 min, Ib er baggrundsintensitet (billede taget før perfusion af et bestemt punkt), i2 er en gennemsnitlig intensitet ved D er kanalens diameter. Andre forskere har rapporteret, at Ptec ‘ er kan resorbere dekstran39, hvilket ville føre til lidt højere værdier for den målte diffusionspermeabilitet.

Vi undersøgte også barriereegenskaberne for vores epitelforede tubuli ved anvendelse af en lavmolekylær forbindelse, inulin (4,5 kDa), der hverken resorberes eller udskilles in vivo af Ptec ‘ er ved hjælp af den samme metode beskrevet ovenfor. Specifikt opløses inulin-FITC (Sigma-produkt F3272) i opvarmede ptec-medier ved 100 liter/mL og perfunderes i det åbne lumen med en hastighed på 20 liter/min i 3 minutter og 1,5 liter/min derefter i ~15 minutter. Hele testen udføres under levende cellebilleddannelse med både tubulen og den omgivende ECM i synsfeltet (Fig. S7). Diffusionsmønsteret af FITC-inulin detekteres ved hjælp af et bredt felt fluorescerende mikroskop (Leica). Fluorescensbilleder optages med en lukket lyskilde og bevægelseskontrolleret trin før perfusion og hvert 3.til 5. minut i løbet af 15. minut for at indsamle tekniske triplikatmålinger.

elektronmikroskopi

til transmissionselektronmikroskopi (TEM) fastgøres Ptec ‘ er i 2D-eller 3d-arkitekturer eller sundt humant nyrevæv opnået fra en standardbiopsi før transplantation ved hjælp af 2,5% glutaraldehyd, 1,25% paraformaldehyd og 0,03% picrinsyre i 0,1 M natriumcacodylatbuffer (pH 7,4) i mindst flere timer. Små prøver (1 mm 1 mm) fjernes og vaskes i 0,1 M cacodylatbuffer og bades i 1% osmiumtroksid (OSO4) (EMS) og 1.5% kaliumferrocyanid (KFeCN6) (Sigma) i 1 time, vasket i vand 3 gange og inkuberet i 1% vandigt uranylacetat (EMS) i 1 time efterfulgt af 2 vasker i vand og efterfølgende dehydrering i forskellige alkoholkvaliteter (10 min hver; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Prøverne sættes derefter i propylenilte (EMS) i 1 time og inkuberes natten over i en 1:1 blanding af propylenilte og TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Canada). Den følgende dag er prøverne indlejret i TAAB Epon og polymeriseret ved 60 liter C i 48 timer. 60 nm) skæres på et Reichert Ultracut-s mikrotom, placeres på Kobbergitter farvet med blycitrat og undersøges i et JEOL 1200eks transmissionselektronmikroskop, og billeder optages med et AMT 2k CCD-kamera. Billedanalyse udføres ved hjælp af ImageJ-programmer.

til scanning af elektronmikroskopi (SEM) fastgøres perfunderede Ptec ‘ er i 3D ved hjælp af 10% bufret formalin i 1 time. prøverne er tyndt skåret (~1 mm tykke) for at eksponere celler, der omskriver det åbne lumen. Fikseringsmidlet vaskes væk ved hjælp af Pbsh2 og efterfølgende dehydrering i forskellige kvaliteter af ethanol (20 min hver; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Prøverne anbringes derefter i 50% ethanol og 50% HMD ‘er i 30 minutter efterfulgt af 100% HMD’ er 3 liter 30 min. Alle trin udføres i en lukket og forseglet glasbeholder. Efter den endelige vask med HMD ‘ er fjernes prøverne og anbringes i en åben beholder under N2 i røghætten for at tørre. Tørrede prøver monteres på aluminiumstiftbeslag ved hjælp af ledende kulstofbånd, sputter belagt med guld og afbildet med en Tescan Vega sem.

immunfarvning

immunfarvning efterfulgt af konfokal mikroskopi bruges til at vurdere den cellulære lokalisering af proteiner i 2D-og 3D-PTEC-modeller. Før immunfarvning vaskes hver konstruktion med PBS og fastgøres derefter i 20 minutter til 1 time ved hjælp af 10% bufret formalin. Fikseringsmidlet fjernes ved hjælp af flere vaske i PBS i flere timer og blokeres derefter natten over ved hjælp af 1 vægt% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Primære antistoffer mod celleproteinet eller biomarkøren af interesse inkuberes med konstruktionerne i 1 dag ved fortyndingerne anført i tabel S2 i en opløsning på 0,5 vægt% BSA og 0,125 vægt% Triton H-100. Fjernelse af ubundne primære antistoffer udføres under anvendelse af et vasketrin mod en opløsning af PBS eller 0,5 vægt% BSA og 0,125 vægt% Triton H-100 i PBS i 1 dag. Sekundære antistoffer inkuberes med konstruktionerne i 1 dag ved fortyndingerne anført i tabel S2 i en opløsning på 0,5 vægt% BSA og 0,125 vægt% Triton H-100 i PBS. Prøver modfarves med NucBlue eller ActinGreen i 2 timer og vaskes derefter i 1 dag i PBS inden billeddannelse.

billedgengivelse og analyse

fasekontraktmikroskopi udføres ved hjælp af et omvendt Leica DM IL-omfang med mål fra 1,25 til 40 gange. konfokal mikroskopi udføres ved hjælp af en opretstående LSM 710 med vandinddypningsmål fra 5 gange til 40 gange ved anvendelse af spektrale lasere ved 405, 488, 514, 561 og 633 nm bølgelængder. Billedrekonstruktioner af å-stakke udføres i ImageJ ved hjælp af å-projektionsfunktionen med den maksimale billedintensitetsindstilling. Enhver stigning i lysstyrke udføres ensartet på tværs af et helt å-projiceret billede. 3D-billedrekonstruktioner og roterende Film (Film S3) udføres ved hjælp af Imaris-programmer. Den nye CytoSMART i inkubator system bruges til at fange time-lapse imaging (Film S2). Billedanalyse til kvantificering af diffusionspermeabilitet udføres ved hjælp af brugerdefinerede MATLAB-scripts, der anvender tidligere rapporterede metoder34. TEM-billedanalyse udføres ved hjælp af ImageJ-programmel til måling af cellehøjde (n-50), mikrovilli-densitet (n-25) og mikrovilli-længde (n-150) over mindst 3 uafhængige prøver for hver tilstand.

statistisk analyse

Data udtrykkes som middel-standardafvigelse. Statistisk analyse udføres ved hjælp af MATLAB, og statistisk signifikans bestemmes til en værdi af p < 0.05 som bestemt af en ANOVA ved hjælp af Tukeys multiple parvise sammenligningstest. Forskellige signifikansniveauer (p-værdier) er angivet med stjerner, og specifikke p-værdier findes i hver figurlegende.