resultater

vi studerede vildtype (vægt), heterosygøs v2rv31r/vægt og homosygøs v2r31r/V2R31R mus. De mutante mus havde normale tal og frekvenser af modne milt-T-celler og thymocytter på hvert udviklingsstadium. På grund af manglen på congeniske markører kan TCR-Kurproteiner ikke identificeres af allelen, der koder for dem, og heller ikke om de inkluderer C-Kurs1 versus C-kurs2-regioner. Således udførte vi strømningscytometri ved hjælp af anti-V2-og anti-V31-antistoffer til at kvantificere celler, der udtrykker v2+ – og V31+ TCR-proteiner. Vi analyserede CD4 + og CD8+ enkeltpositive (SP) thymocytter, da de er modne og naive T-celler. Reflekterende offentliggjorte data (8, 9) opdagede vi en lille fraktion (0,11%) af celler, der farvede med begge antistoffer i VÆGTMUS (Fig. 1 B og C), hvilket er i overensstemmelse med en lille population af V2+V31+ – T-celler. Vi observerede en 12,4 gange forøget fraktion af disse celler i v2r31r/vægt mus og en 32,8 gange stigning i v2r31r/V2R31R mus (Fig. 1 B og C). Disse forhøjede frekvenser af dual-TCR-Kurt+ – celler svarede til de større udnyttelser af V2 og V31 i udtrykte TCR-Kurstkæder (Fig. 1 D-F). Disse data viser, at forbedring af RSS-kvaliteten af to V-KRP ‘ er på den samme allel øger deres omlejring og følgelig fraktionen af T-celler, der udtrykker to forskellige typer TCR-KRP-proteiner. Da V-Relativerpertoiret af SP-thymocytter afspejler de relative niveauer, som individuelle V-Kurssegmenter rekombinerer (10), afslører den foretrukne anvendelse af V31 frem for V2, at V31R udkonkurrerer V2R til omlejring. Dette kan skyldes større tilgængelighed af V31 (11) eller interaktion mellem V31 og D–Kurt–J-Kurt-segmenter, før TCR-Kurt Locus-sammentrækning placerer V2 nær D-Kurt-J-Kurt-segmenter. Især indebærer den højere end dobbelt stigning af disse dual-TCR-Kurr+ – celler i v2r31r/V2R31R-mus sammenlignet med v2r31r/vægt-mus, at to forskellige V(D)J-Kurr-omlejringer kan bidrage til TCR-kurr-ekspression fra den samme allel.

for At afgøre, om en enkelt TCRß allel kan faktisk støtte udtryk for TCRß proteiner fra to forskellige V(D)Jß omrokeringer, vi har analyseret mus, hvor man TCRß allel er inaktiveret ved sletning af TCRß forstærker (Eß) (12, 13). Vi analyserede mus, der bærer den e-LARP-slettede allel overfor en vægt-allel, en allel med en RSS-udskiftning af enten V2 (V2R) eller V31 (V31R) eller begge dele (8). Vi opdagede en lille procentdel (0,094%) af V2+V31+ SP-thymocytter i vægt/e-Kur-mus (fig. 2 A og B), der potentielt repræsenterer en sjælden population af celler, der udtrykker to forskellige TCR-Kurproteiner fra den samme vægt-allel. Uanset hvad observerede vi V2+V31+ celler ved en 1,9 gange større frekvens i V2R/e-Mus og ved en 4,8 gange større frekvens i V31r/e-mus (fig. 2 A og B). Således forbedrer kvaliteten af begge V-RSS RSS fraktionen af celler, der udtrykker både V2+ – og V31+ TCR-Prisproteiner. Især opdagede vi en 14,4 gange øget frekvens af V2+V31+ celler i V2rv31r/e-mus i forhold til vægt/e-mus (fig. 2 A og B), hvilket indikerer, at forbedring af kvaliteten af to V-kar-RSS ‘ er synergistisk øger procentdelen af celler, der udtrykker både V2+ – og V31+ TCR-Prisproteiner. Faktisk sletning af en del af V31 RSS på V2R-allelen (V2R31-allelen; Fig. 2C) reducerer frekvensen af v2+V31+ celler dramatisk til niveauer, der er ækvivalente eller mindre end i V2R/e-musene (0,178% versus 0,135%; fig. 2 A og B). Samlet set bekræfter disse data, at V2R31R-allelen fremmer ekspression af to forskellige TCR-Kurproteiner fra to forskellige V(D)J-omlejringer på en enkelt allel.

vores undersøgelse viser, at en iboende genetisk mekanisme styrer monogen TCR-samling og ekspression. Vi viser, at dårlig kvalitet V-KRP RSS ‘ er samarbejder om at begrænse samling og ekspression af to forskellige TCR-KRP-gener fra en allel. Vi har tidligere vist, at dårlig kvalitet V-RSS ‘ er stokastisk begrænser v-kur-rekombinationsfrekvens før feedbackinhibering for at mindske biallelisk samling og ekspression af TCR-kar-gener (8). Vi konkluderer nu yderligere, at lavkvalitets V-KRP RSS ‘ er også sænker forekomsten af, at både V31 og en opstrøms V-KRP rekombineres på den samme allel. Disse omrokeringer kunne involvere enten 1) en deletional V2 omlægning til Dß1–Jß1–Cß1 klynge og en inversional V31 omlægning til Dß2–Jß2–Cß2 klynge, eller 2) en inversional V31 omlægning til Dß1–Jß1–Cß1 klynge, der inverterer en del af det locus, der indeholder Dß2–Jß2–Cß2 klynge, og derefter en inversional V2 omlægning til Dß2–Jß2–Cß2 klynge (7) (Fig. 2D). For at opnå monogen TCR-samling og-ekspression kan denne RSS-baserede genetiske mekanisme fungere med epigenetiske processer, der er blevet impliceret for at håndhæve monoallelisk V-rekombination. For eksempel har det været foreslået, at dynamiske vekselvirkninger af Vß segmenter med nuklear lamina sænker Vß rekombination effektivitet ved at undertrykke Vß kromatin tilgængelighed og kromosom looping mellem Dß–Jß klynger og opstrøms Vß segmenter (14, 15). I denne forbindelse, dårlig kvalitet Vß RSSs kan mindske sandsynligheden for, at to Vß omrokeringer forekomme på en allel, når V31 og en upstream-Vß segment er både tilgængelige og upstream Vß er tilbage i nærhed med Dß–Jß segmenter. Således kan egenskaberne af RSSs ligge til grund for monogen samling og ekspression af pattedyrs tcry, TCR-og Ig-proteiner i pattedyr og ig-proteiner i bruskfisk. Derudover kan V RSS ‘ er på samme måde bidrage til Igk-og Igrisotypisk udelukkelse i B-celler.