forsøgspersoner, kliniske prøver og HLA-genotypebestemmelse. Alle forsøgspersoner med en historie med blodtransfusion blev udelukket fra undersøgelsen. Toogtredive familier med en historie med simpel sklerodermi blev rekrutteret og undersøgt for HLA klasse II og klasse i alleler; 3 generationer blev undersøgt for 20 familier og 2 generationer for 12 familier. Tre generationer var nødvendige for studieindgang for alle kvinder med børn, og deltagelse af alle børn var påkrævet, fordi mikrochimerisme kunne stamme fra moderen eller fra et barn i disse emner. Deltagelse af mænd, børn og aldrig gravide kvinder omfattede 2 generationer (dvs.emnet og moderen). En sklerodermipatient var en tvilling; den upåvirkede tvilling blev også rekrutteret til undersøgelsen. Treogtredive sunde kontrolfamilier blev rekrutteret, herunder 22 med 3 generationer og 11 med 2 generationer. HLA-genotypebestemmelse blev afsluttet for i alt 254 individer: 128 i sklerodermafamilier og 126 i kontroller. Nogle yderligere familiemedlemmer blev inkluderet for at bekræfte HLA haplotype-opgaver. Fra denne database blev forsøgspersoner udvalgt til yderligere undersøgelse, da motivets mor havde en ikke-delt HLA-allel, der var målrettet mod HLA-specifikke analyser. Alle emner givet informeret samtykke som godkendt af Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionel gennemgang Board.

Pbmc ‘ er blev isoleret fra hele hepariniseret blod ved fortynding i HBSS efterfulgt af Ficoll-Hypak (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) gradientcentrifugering ved 1,077 g / mL. For nogle børn blev DNA ekstraheret fra hårrødder til HLA-typning som beskrevet tidligere (9). Genomisk DNA blev ekstraheret fra Pbmc ‘ er ved anvendelse af et Isokick-Nukleinekstraktionssæt (Orca Research Inc., Bothell, USA) i henhold til producentens anvisninger og resuspenderet i 10 mM Tris-HCl (pH 9.0). DNA-mængde og renhed blev bestemt ved standard spektrofotometriske metoder. For nogle forsøgspersoner blev DNA ekstraheret direkte fra fuldblodsprøver.

DNA – baseret typning med sekvensspecifikke oligonukleotidprobe paneler blev brugt til at identificere specifikke alleler ved DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DKA1 og DKB1 loci. For DRB1 registrerer et indledende lavopløsningsassay DRB1-familier DBR1 * 01 til DRB1*14 og efterfølges af 1 eller flere højopløsningsassays, der identificerer specifikke DRB1-alleler som beskrevet tidligere (10, 11). DKA1-og DKB1-alleler blev bestemt ved hjælp af metoder svarende til dem, der er beskrevet tidligere (9), med yderligere prober tilføjet for at detektere nyligt identificerede alleler (12). HLA-klasse i-antigener blev bestemt ved anvendelse af et standard lymfocytotoksicitetsassay, der diskriminerer 20 HLA-a, 30 HLA-B og 8 HLA-HV-antigener. Nogle prøver blev underkastet sekventering for at bestemme specifikke HLA klasse i-alleler (13). For at bekræfte HLA — allel-og antigenopgaver og homosygositet blev flere familiemedlemmer genotypet-inklusive fædre og søskende til forsøgspersoner, når de var tilgængelige.

HLA-specifikke PCR-primere. Primersekvenser blev designet baseret på alle kendte allelsekvenser (12). Primer syntese blev udført af Oligos Etc. (Oregon, USA). Et primersæt blev designet til at målrette mod en HLA klasse i-polymorfisme og 3 målrettede HLA klasse II-polymorfier. For at målrette mod HLA-B44 blev der designet en primer, der forstærker en gruppe af HLA-B-alleler baseret på polymorfier i position 66, 69 og 75 i ekson 3 og en anden gruppe af HLA-B-alleler baseret på en polymorfisme i position 229 i ekson 3. Kombinationen af primere forstærker specifikt HLA-B44-alleler, der producerer et 190-BP-fragment. Alle DRB-specifikke primere blev designet til at forstærke allelgrupper baseret på sekvenspolymorfier i det hypervariable område af ekson 2. For HLA-DRB5 * 01 forstærker den ene primer en gruppe DRB5*01-alleler baseret på polymorfier i positionerne 25, 26, 31, 32 og 38, og den anden forstærker en gruppe DRB5*01-alleler baseret på polymorfier mellem positionerne 215 og 231. Kombinationen af primere forstærker specifikt HLA-DRB5*01 alleler, der producerer et 210-BP fragment. For HLA-DRB1 * 04 forstærker den ene primer en gruppe DRB1*04-alleler baseret på polymorfier i positionerne 25, 26, 31 og 36, og den anden forstærker en gruppe DRB1*04-alleler baseret på polymorfier i positionerne 97 og 110. Kombinationen af primere forstærker specifikt DRB1 * 04 og producerer et 104-BP-fragment. Yderligere diskrimination blandt DRB1 * 04 alleler blev opnået ved anvendelse af den tidligere primer sammen med 1 af 2 primere, der diskriminerer en dimorfisme ved position 258 (codon 86), hvilket producerer et 263-bp fragment. For HLA-DRB1 * 11 forstærker en primer en gruppe DRB1 * 11 alleler baseret på polymorfier i positioner 25, 26, 28, 30, 31, 32, og 35 af ekson 2, og den anden primer forstærker en gruppe af DRB1*11 alleler baseret på polymorfier i position 173 og 174 i ekson 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR–reaktioner blev udført i et volumen på 50 liter indeholdende 1,25-1,5 liter genomisk DNA, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% vægt/volumen gelatine, 260 liter/L af hvert DEOKSYNUKLEOTID, 0,5 U perfekt match PCR-forstærker (Stratagene, La Jolla, Californien, USA), 2,5 U Amplitak Guld-DNA-polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) og 20 pmol af hver HLA-specifik primer. Ultrapure vand blev tilsat for at udgøre det endelige volumen på 50 liter. Forstærkningen bestod af 5 minutter ved 96°C, 35 cyklusser ved 95°C i 35 sekunder, og ved 65°C til 35 sekunder for HLA-B44 (58.5°C til DRB5*01; 72°C for DRB1*04; FOR 64,5°C til DRB1*11), og derefter 72°C i 1 minut, med en endelig udvidelse trin ved 72°C i 10 minutter. Optimal amplifikation, følsomhed og specificitet blev opnået ved titrering af MgCl2 og primerkoncentrationer, antal termocykler og udglødningstemperatur. Alle forstærkninger blev udført i et GeneAmp-System 9600 termocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Assayfølsomhed blev bestemt ved spiking-eksperimenter, hvor mål-DNA blev serielt fortyndet og tilsat til en fast mængde baggrunds-DNA svarende til alleler af emnet. De HLA– B44-og DRB5*01-specifikke PCR– assays var i stand til at detektere mindst 1 målcelle i en baggrund på 500.000 celler; de HLA-DRB1*04-og DRB1*11-specifikke PCR-assays var i stand til at detektere mindst 1 målcelle i en baggrund på 100.000 celler. Hver PCR-analyse omfattede følgende kontroller: (a)en positiv kontrol af DNA fra en cellelinie med HLA–allelen af interesse (0,2-0,5; (b) en positiv kontrol fra forsøgspersonens mor (0,2–0,5 larg); (c) negativ kontrol af DNA fra en cellelinie med de samme HLA-alleler som forsøgspersonen (1,25 larg og 0,35 larg); og (d) en negativ kontrol bestående af alle PCR-reagenser uden DNA. PCR-produkter blev elektroforeseret ved 100 V konstant spænding i 1 time i 6% eller 8% præfabrikerede TBE-geler ved anvendelse af en Noveks II Mini-celle (Noveks, San Diego, Californien, USA). Hver gel omfattede positive og negative PCR-kontroller og en 100-BP-stige (SLL-100; Gensura, del Mar, Californien, USA). Geler blev farvet med sølvfarve (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Californien, USA) og tørret med DryEase Gel tørringssystem. DNA ekstraheret fra fuldblod blev testet i 4 prøver af utilstrækkelig mængde til at isolere Pbmc ‘ er. Alle test blev udført i to eksemplarer, og de fleste prøver blev analyseret mere end en gang.

PCR-forholdsregler. Der blev anvendt ekstrem forsigtighed for at undgå og opdage mulig PCR-kontaminering. Separate områder blev brugt til pbmc-adskillelse, ekstraktion af genomisk DNA, PCR-opsætning og amplifikation og analyse af PCR-produkter med før og efter PCR-test udført i separate laboratorier. Aerosolresistente pipettespidser (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Californien, USA) blev anvendt i alle eksperimenter, og flere negative kontroller blev inkluderet i alle PCR-amplifikationer.

sekventering af HLA-specifikke PCR-produkter. Syv mikroliter af det oprindelige HLA-specifikke PCR-produkt blev underkastet yderligere 40 amplifikationscyklusser under anvendelse af de originale termocyclingparametre. Tredive mikroliter af dette PCR-produkt blev elektroforeseret i en 1,75% ultrapure agarosegel (GIBCO BRL, Grand Island, Ny York, USA) og farvet med en opløsning af ethidiumbromid (0,5 liter/mL). Bandet blev udskåret, elueret og oprenset ved hjælp af et Gelekstraktionssæt., Valencia, Californien, USA). Det oprensede PCR-produkt blev elueret til 30 liter på 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0), og 100 ng blev tilsat til en reaktionsblanding indeholdende 8,0 liter sekventeringsreagens forblanding (Termosekvenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol 5′ eller 3′ primer og 1 liter DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Ultrapure vand blev tilsat for at gøre et endeligt volumen på 20 liter. Sekventeringsreaktionsblandingerne blev opvarmet ved 96 liter C i 3 minutter i et GeneAmp-System 9600 termocycler efterfulgt af 25 cyklusser ved 96 liter C i 10 sekunder, 50 liter C i 5 sekunder og 60 liter C i 4 minutter. Resulterende PCR-produkter blev søjlerensede og elektroforeserede som ovenfor. Sense-og antisense-sekvenser blev bestemt i to eksemplarer for forsøgspersonens og moderens HLA-specifikke PCR-produkter såvel som for positive kontrolcellelinie PCR-produkter. Sekvensanalyse blev udført ved hjælp af programmet version 9.1 fra Genetics Computer Group (Madison, USA).

Cytospin slide forberedelse og in situ hybridisering. Ved anvendelse af en teknik udviklet i Fred Hutchinson Cancer Research Center Molecular Cytogenetics Laboratory til kvantitativ analyse af kimærisme i køn-uoverensstemmende stamcelletransplantationspar (14). Cytospinprøver af hanceller blev fremstillet ved centrifugering af 30.000–60.000 frisk adskilte Pbmc ‘ er på glasrutschebaner, 300 liter pr. Slides blev opbevaret i et tørrekammer indtil brug. Den kromosom-specifikke probe DKS1 (15) blev nick-oversat med digoksigenin, og Den y–kromosomspecifikke probe DYKS1 (16) blev nick-oversat med biotin. I hybridiseringsbuffer på 50% formamid, 2 liter SSC (0,3 M natriumchlorid og 0,03 M natriumcitrat) og 10% dekstransulfat. Det blev denatureret ved 72 liter C i 5 minutter, afkølet på is og påført objektglasset. Slides blev fordøjet i pepsin (0,1 mg/mL i 0.01 M HCl) ved 37 liter C i 3 minutter, fikseret i 4% bufret formalin i 15 minutter, skyllet i PBS, dehydreret i ethanol (70%, 95% og 100%) og lufttørret. Slides blev denatureret ved behandling i 2 liter SSC (72 liter C) i 10 minutter, 70% formamid, 2 liter SSC (72 liter C) i 3 minutter, dehydreret i en ethanolserie (-20 liter C) og lufttørret. Ti mikroliter sonde blev påført objektglasset og derefter monteret under et dækglas (22 liter 22 mm) forseglet med gummicement. Det blev inkuberet natten over ved 42 liter C i et befugtet kammer. Slides blev vasket i 55% formamid, 2 liter SSC (45 liter C) i 15 minutter og 2 liter SSC (stuetemperatur) i 5 minutter. Probesignaler blev samtidigt detekteret med fluorescein-koblet anti-digoksigenin (1:500 fortynding; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) og rød–koblet avidin (1: 500 fortynding; Vector Laboratories, Burlingame, Californien, USA) i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter vask med 2 liter SSC og PBS blev de monteret med VECTASHIELD (Vector Laboratories). Slides blev evalueret direkte ved hjælp af et Nikon E600 epifluorescensmikroskop med en 100-væg kviksølvlampe udstyret med passende enkelt -, dobbelt-og tredobbelt båndpasfiltre. Kun celler med 2 synlige kromosomsignaler blev opregnet uden brug af nogen elektronisk forbedring.