2.1 anaerob respiration

under respiration ilter forskellige membranassocierede dehydrogenaser vandopløselige substrater og reducerer menakinon (MK) i membranen til menakinol. Under aerobe forhold bruges elektronerne til at reducere ilt til vand, mens nitrat respiratoriske vækstelektroner under anaerobe forhold overføres til nitrat for at give nitrit (Fig. 5.1). En vigtig elektrondonor af respiration er NADH + H + produceret i glykolyse og tricarkasylsyrecyklussen. To typer af membranbundne NADH-dehydrogenaser, NDH-i og NDH-II, er blevet beskrevet for bakterier til at katalysere iltningen af NADH+H+ til NAD+ (Yagi, 1993). NDH-I består af 14 underenheder, kodet af nuo operon i Escherichia coli, og indeholder flavinmononukleotid (FMN) og flere jern–svovlklynger til par elektronoverførsel til protonpumpning over membranen. NDH-II består af en enkelt underenhed kodet af ndh-genet. NDH-II er ikke et integreret membranprotein, men forbundet med den indre side af den cytoplasmatiske membran. Det indeholder flavin adenindinukleotid (FAD) som protesegruppe, og elektronoverførsel er ikke koblet til protontranslokation. I B. subtilis-genomet koder tre gener, yjlD, yumB og yutJ potentielle NADH-dehydrogenaser af NDH-II-typen, mens en nuo-operon er fraværende fra B. subtilis-genomet (Kunst et al., 1997). YjlD, omdøbt til Ndh, består af 392 aminosyrerester og viser 29% sekvensidentitet til NDH-II af E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Interessant nok er mængden af Ndh-protein af B. subtilis blev fundet signifikant reduceret under anaerobe forhold (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobits, & Jahn, 2000). Ndh synes at være den vigtigste aerobe NADH-dehydrogenase af B. subtilis, da mutation af ndh-genet udviste en aerob vækstdefekt (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). I mellemtiden blev det vist, at ekspression af yjlc-ndh-operonen er reguleret af regulatoren, en omkoks-sensing transkriptionsregulator, der reagerer på NADH/NAD+ – forholdet (se også afsnit 3.3) (Gyan et al., 2006). I modsætning hertil blev ekspressionen af yumB-genet fundet induceret under nitrat-respiratoriske tilstande i transkriptomundersøgelser (E. H-Kurrtig, upublicerede resultater). Hvorvidt YumB og YutJ har NADH-dehydrogenaseaktivitet som foreslået af proteinsekvenslighed, og om de er relevante under nitrat respiratoriske vækstbetingelser, skal bestemmes.

ligesom andre aerob-respirerende organismer besidder B. subtilis en succinatdehydrogenase (sdh) eller mere præcist et succinat:kvinonoksidoreduktase, KVR (h-RRR, 1997). Den er en del af den cytoplasmatiske membran i bakterier og den indre mitokondrie membran i eukaryoter. Dette er en af de mest almindelige årsager til, at sukkinat er blevet inficeret med fumarat. Dette er en funktionel del af både citronsyrecyklussen og luftvejskæden (H. H., Aasa, von Vachenfeldt, Hederstedt, 1992). Subtilis reducerer MK og har tre proteinunderenheder, SdhA, SdhB og SdhC. SdhA er et flavoprotein med en kovalent bundet FAD, der udfører de to elektronoksidering af succinat til fumarat i cytoplasmaet. SdhB indeholder tre jern-svovlklynger (, og), der fungerer i elektronoverførsel mellem flavin-gruppen og hæm b af cytochrom b558 i SdhC. SdhC har fem transmembrane Kris-spiralformede segmenter og forankrer SdhAB-dimeren på den cytoplasmatiske side af membranen og fungerer i transmembranelektronoverførsel til MK (Hederstedt, Maguire, krig, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoy, Aasa, & Hederstedt, 2000). De to heme b-cofaktorer formidler overførsel af elektroner over den cytoplasmatiske membran til ydersiden af membranen, hvor MK reduceres, og to protoner forbruges (Hederstedt, 2002). Dette adskiller sig fra E. coli, hvor protonerne til reduktion af allestedsnærværende til allestedsnærværende forbruges på den negative side af membranen, hvilket ikke påvirker membranpotentialet. B. subtilis og andre baciller, såsom bacillus megaterium og Bacillus cereus stammer, kan vokse under oksiske forhold med succinat som kulstof og energikilde (Schiravski & unen, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium og B. cereus vokser ikke under anaerobe forhold i nærvær af glycerol. Efter aftale mangler gener for en glycerol-3-dehydrogenase i genomerne. Imidlertid blev et glpD-gen til den aerobe variant af det membranlokaliserede elektronoverførselssystem detekteret i B. subtilis. Der blev ikke fundet nogen homologi for gener, der koder for andre primære dehydrogenaser, der er til stede i E. coli, såsom forskellige formatdehydrogenase, hydrogenaser, l-lactatdehydrogenase, d-aminosyredehydrogenase, malat:kinonoksidoreduktaser eller kinoproteinglucosedehydrogenase. Det er klart, at B. subtilis kun besidder et begrænset sæt primære elektrondonerende dehydrogenaser, nemlig forskellige former for NDH-II og aerob glycerol-3-phosphatdehydrogenase.under aerobe forhold overføres elektronerne fra menakinol via cytokrom bc1-komplekset til cytokrom C-oksidasen af AA3-typen. Under mikroaerofile tilstand anvendes cytokrom BD-type menakinoloksidase med høj iltaffinitet. Fumarat som terminalelektronacceptor blev udelukket for forskellige baciller, herunder B. subtilis (Schiraski & uden, 1995). Følgelig findes gener for en fumaratreduktase ikke i B. subtilis-genomet. Andre baciller stammer, såsom Bacillus licheniformis og Bacillus circulans, kan respire fumarat ligesom E. coli.

under anaerobe vækstbetingelser overfører B. subtilis elektronerne udelukkende til respiratorisk nitratreduktase. I bakterier klassificeres tre forskellige nitratreduktasesystemer: de cytoplasmatiske assimilatoriske NAD(P)H-afhængige nitratreduktaser (Nas), den membranbundne respiratoriske nitratreduktase (Nar) og de periplasmiske forskellige nitratreduktaser (Nap). Alle tre hører til DMSO-reduktasefamilien af proteiner og indeholder bis-molybdopterin guanindinukleotid (MGD) cofaktor (Moreno-Vivian, Cabello, Martins-Luk, Blasco, & Castillo, 1999). B. subtilis-genomet koder kun for respiratorisk nitratreduktase Nar. De er typisk sammensat af tre underenheder. Den store underenhed NarG indeholder det aktive sted med MGD cofaktor, en mindre opløselig underenhed NarH har et og tre Centre, og underenhed NarI er en cytokrom b. Nar er en kvinoloksidase, og menakinolpuljen iltes af cytokrom b-underenheden NarI. To elektroner strømmer via heme B af NarI til jern-svovlklyngerne i NarH og til sidst til den cytoplasmatiske underenhed NarG, som reducerer nitrat til nitrit. NarJ-proteinet er ikke en del af stoffet, men kræves til den endelige samling af det membranbundne stof (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippauks, 1990; Sakian et al., 2010). På grund af de forskellige steder for kvinoloksidering i periplasmen og for nitratreduktion i cytosolen bidrager nitratreduktase Nar til dannelsen af en protongradient (Fig. 5.1). Nar locus består af narGHJI operon (koder for respiratorisk nitratreduktase), narK (for et potentielt nitritekstruderingsprotein), den åbne læseramme yvic (med ukendt funktion), arfM, der koder for modulatoren for anaerob respiration og fermentering, og også genet for den anaerobe regulator Fnr., 1995; Kunst et al., 1997).nitrit omdannes derefter yderligere til ammoniak ved hjælp af den assimilative nitritreduktase NasDE., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & til, 1998). En af de mest almindelige typer NITRITREDUKTASE er nitritreduktase, der bruges til at reducere nitrit til ammonium. Nitritreduktase-generne nasDE var en del af en nasDEF-operon og blev fundet umiddelbart nedstrøms for nasBC-operonen, som koder for den NADH-afhængige nitratreduktase (Nakano, Yang, Hardin, & Suber, 1995; Ogava et al., 1995).