abstrakt

Myoepithelium er til stede i hunde brysttumorer som hvile og proliferativ suprabasal og spindel og stellat interstitielle celler. Formålet med dette papir var at evaluere et panel af markører til identifikation af fire forskellige myoepithelialcellemorfologiske typer i den normale og neoplastiske brystkirtel og at undersøge immunhistokemiske ændringer fra en epitel til en mesenkymal fænotype. Cytokeratin 19 (CK19), cytokeratin 5/6 (CK5/6), cytokeratin 14 (CK14), østrogenreceptor (ER), P63-protein, vimentin (VIM) og karrus-glat muskelaktin (Alfa-SMA) antistoffer blev anvendt på 29 neoplasmer (3 godartede og 3 ondartede myoepiteliale tumorer, 7 carcinomer i godartede blandede tumorer og 16 komplekse carcinomer) og på normalt væv i brystkirtler. Alle disse antistoffer blev også testet på 3 brystvæv fra dyr uden brystpatologi. De myoepitheliale markører blev godt udtrykt i de suprabasale celler og gik gradvist tabt i de bevægelige typer, hvor stellatcellerne kun opretholdt Vim-ekspression typisk for mesenchyma. ER mærket nogle hvile og bevægelige myoepitheliale celler. På baggrund af vores resultater foreslår vi en overgang fra myoepiteliale immotile celler til migrerende fibroblastlignende celler. Denne overgang og karakteriseringen af et immunhistokemisk panel til hvile og bevægelige myoepiteliale celler kaster mere lys over den biologiske opførsel af myoepiteliale celler.

1. Introduktion

brystkirteltumorer hos hunde dannes af både epitel (epitel og myoepithelium) og mesenkymale komponenter. Oprindelsen af de mesenkymale celler diskuteres stadig. Den forhøjede frekvens af tumorer, der viser myoepithelial eller basalcelleproliferation, er et unikt træk ved brysttumorer hos hunde .

i den normale brystkirtel afgrænses lumina af et indre lag af polariserede epitelceller, der hviler på to ydre eller basale lag af epitel-og myoepitelceller . Både basale og myoepiteliale celler syntetiserer kældermembranen i kanaler og alveoler og danner en strukturel barriere mellem de luminale epitelceller og den omgivende stroma . I kanaler danner myoepitelceller et næsten kontinuerligt lag af celler orienteret parallelt med kanalernes lange akse. Dette lag omgiver de luminale epitelceller og adskiller dem fra kældermembranen og stroma. I alveoler er myoepithelialcellerne diskontinuerlige og danner et kurvlignende netværk omkring alveolerne, hvilket tillader nogle luminale epitelceller at kontakte kældermembranen direkte . Derfor er myoepithelium ikke kun placeret i en ideel position til at kommunikere mellem disse to rum, men det er også placeret til at tilvejebringe vigtige regulatoriske signaler til opretholdelse af normal cellestruktur .

baseret på immunhistokemi viser de tre lag af celler i den normale brystkirtel forskellige markører: det luminale epitel er mærket af CK19, og basalcellerne og myoepitelialcellerne farves af CK5/6 og CK14 og p63, Alpha-SMA og vim . Myoepitheliale celler er kontraktile elementer, der udviser en kombineret epithelial og glat muskel immunoprofil. Markørerne nævnt ovenfor udtrykkes i cytoplasmaet, bortset fra p63, som er en nuklear markør . Myoepithelialcellelaget er den eneste kilde til tumorundertrykkende p63, som er signifikant hæmmet ved proliferation og invasion af associerede tumorceller . Derudover mærkes basale myoepitheliale celler i den normale brystkirtel lejlighedsvis af er-antistof, som bruges til den molekylære baserede klassificering af brysttumorer hos hunde .

forskellige myoepitheliale cellemorfologier kan genkendes i hunde komplekse og blandede tumorer: hvilende og proliferative suprabasale myoepitheliale celler og spindel-og stellatmotile interstitielle myoepitheliale celler. Suprabasale celler er placeret mellem kældermembranen og luminalepitelet og udviser flad spindel (hvilende celler) eller polygonale morfologier (proliferative celler). Interstitielle celler er ofte arrangeret i faste reder, der er anbragt på epitelelementer eller isoleret i interstitiet . Spindel og stellat myoepitheliale celler differentierer sig mod en mere generel kontraktil fænotype .

interstitielle myoepitheliale celler kan til sidst blive fibroblastlignende celler, der kun viser Vim-immunreaktivitet . Den myoepitheliale differentiering kan kulminere i dannelsen af forskellige mesenkymale væv, herunder brusk og knogler i hunde bryst blandet tumor.

erhvervelsen af typiske træk ved mesenkymale celler vil sandsynligvis stamme gennem epithelial-mesenkymal overgang (EMT). EMT er et biologisk fænomen, der tillader en polariseret epitelcelle, som normalt interagerer med kældermembranen via dens basale overflade, at gennemgå flere biokemiske ændringer, der gør det muligt for den at påtage sig træk og funktioner af mesenkymale celler .

dette papir vil fokusere på forskellige aspekter af myoepitheliale celler og brysttumorer hos hunde, specifikt (1) karakterisering af de fire forskellige myoepitheliale cellemorfologiske typer i den normale og neoplastiske brystkirtel ved hjælp af et panel af antistoffer og (2) de immunhistokemiske ændringer i myoepitheliale celler fra en epitel til en mesenkymal fænotype.

2. Materialer og metoder

2.1. Prøver

Brystkirtelprøver af 29 hundehunde blev hentet fra databasen for den Anatomopatologiske tjeneste ved fakultetet for veterinærmedicin i Bologna. De emner, der hørte til forskellige racer: køter (𝑛=13), schæferhund (𝑛=3), Puddel (𝑛=3), Yorkshire Terrier (𝑛=3), Gravhund (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Pointer (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzere (𝑛=1), og Siberian Husky (𝑛=1); de var alle kvinder, med en gennemsnitlig alder på 9.20±2.28 år (mean ± SD). Tumorerne bestod af: 3 godartede myoepitheliale tumorer, 3 ondartede myoepitheliale tumorer, 7 carcinomer i godartede blandede tumorer og 16 komplekse carcinomer (de sidste to grupper blev differentieret ved tilstedeværelsen af brusk og/eller knogle i de blandede tumorer). Derudover blev 29 prøver fra normale brystkirtler i den samme tumorlinie og 3 brystprøver fra 3 raske ikke-mammære tumorbærende hunhunde evalueret.

tumorer blev klassificeret i henhold til Misdorp et al. og Goldschmidt et al. i godartede myoepitheliale tumorer: en sjælden neoplasma sammensat af myoepitheliale celler arrangeret i korte bundter blandet med et ekstracellulært fibrillært basofilt materiale; ondartede myoepitheliale tumorer: forskellig fra den godartede variant med mere polymorfe myoepitheliale celler; komplekst karcinom: et carcinom sammensat af både luminale epitel-og myoepitelkomponenter; carcinom i godartet tumor: en tumor med foci af malignt udseende epitelceller eller forskellige knuder af sådanne celler, der forekommer sammen med mesenkymale celler, der har produceret brusk og/eller knogle muligvis i kombination med fibrøst væv.

2, 2. Immunohistokemi

fire tykke sektioner blev skåret fra formalinfast paraffinindlejrede blokke indeholdende repræsentative tumorprøver. Immunhistokemi for følgende markører blev udført på disse væv: CK19, ER, CK5 / 6, CK14, Vim, Alpha-SMA, p63.

sektioner blev afvokset i toluen og rehydreret. Endogen peroksidase blev blokeret ved nedsænkning i 0,3% brintoverilte i 20 minutter. Sektioner blev derefter skyllet i Tris buffer. Antigenudtagning blev udført med citratbuffer (2,1 g citronsyremonohydrat/liter destilleret vand), pH 6,0 (undtagen CK5/6 og ER, som brugte EDTA, pH 8,0) og opvarmning i to 5 min perioder i en mikrobølgeovn ved 750 V efterfulgt af afkøling ved stuetemperatur i 20 min. De primære antistoffer er opsummeret i tabel 1. Alle primære antistoffer blev inkuberet natten over ved 4 C, efterfulgt af en kommerciel streptavidin-biotin-peroksidase-teknik (Lsab Kit, Dako, Amsterdam, Holland). Diaminobensidin (0,05% i 10 minutter ved stuetemperatur) blev anvendt som kromogen. Slides blev modfarvet med papanicolaous hæmatoksylin.

som en negativ kontrol blev det primære antistof erstattet med et irrelevant, isotype-matchet antistof til kontrol for uspecifik binding af det sekundære antistof. Positive vævskontroller ved hjælp af de samme IHC-protokoller omfattede hunde normal brystkirtel (anti-ck19,- ER,- CK14,-vim, Alpha-SMA,-p63 antistoffer) og hunde hud (anti-CK5/6).

antallet af positive celler ved hver markør blev beregnet semikvantitativt: − = ingen farvede celler, liter = mindre end 5% positive celler, + = 5-50% positive celler, ++ = mere end 50% positive celler. Tilfælde blev betragtet som positive for ER, når nuklear farvning blev observeret i mindst 5% tumorceller .

3. Resultater

fire typer myoepiteliale celler blev genkendt på grundlag af deres morfologi. Den hvilende undertype udviste de aflange træk ved spindelceller i tæt kontakt med luminale epitelceller såvel som prolifererende suprabasale celler, der i stedet viste en polygonal form (figur 1(a)). De interstitielle bevægelige celler blev observeret både danner reder (spindeltypen foret reder og stjerneceller udgjorde reden kerne) og isoleret i interstitium(figur 2 (a)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

(h)

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anti-VIM-antistoffer, der mærker cytoplasmaet; (g) Anti-Alfa-SMA-antistoffer, der mærker den cytoplasmatiske membran; (h) anti-p63-antistoffer, der mærker kernerne.

3.1. Normal brystkirtel

i de 3 kontroltilfælde blev alle hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler mærket af p63, CK14, Alpha-SMA og vim. Hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler udtrykte ikke CK19 i nogen af tilfældene.

3.2. Brystvæv fra samme linje af brysttumoren

i de 29 normale væv i samme linje som tumorerne blev alle hvilende og proliferative suprabasale myoepitheliale celler mærket af p63, CK14, Alpha-SMA og vim. CK5 / 6 var positiv i alle undtagen fire tilfælde, og ER blev påvist i 12 tilfælde. Ck19-ekspression blev kun observeret i luminalepitelet. Myoepitheliale bevægelige interstitielle celler blev ikke observeret. Alle resultater er opsummeret i tabel 2.

3.3. Brysttumorer

immunhistokemiske resultater for suprabasal (Figur 1) og bevægelige celler (figur 2) ved anvendelse af p63, CK14, CK5/6, CK19, Alpha-SMA, VIM og er er opsummeret i tabel 2. CK5 / 6 mærket: suprabasale hvilende celler i 16 af de 29 tilfælde (5 carcinomer i godartede blandede tumorer og 11 komplekse carcinomer). CK 5/6 mærkede også proliferative suprabasale og spindelmotile celler i 10 tilfælde (3 carcinomer i godartede blandede tumorer og 7 komplekse carcinomer). Stellatmotile celler var til stede i 25 tilfælde (1 godartet myoepithelial tumor, 3 ondartede myoepitheliale tumorer, 5 carcinomer i godartede blandede tumorer og 15 komplekse carcinomer), men var negative for CK5/6. Brusk i brystblandede tumorer var altid negativ.

CK14 viste positivitet i 23 tilfælde i hvilende celler (med undtagelse af 1 komplekst karcinom og godartede og ondartede myoepitheliale tumorer), i 22 tilfælde i proliferative celler (6 carcinomer i godartede blandede tumorer og 15 komplekse carcinomer) med en tendens til at miste ekspressionen, når disse celler havde erhvervet den mere bevægelige fænotype af spindelceller (positiv i 2 godartede og 3 ondartede myoepitheliale tumorer, 2 carcinomer i godartede blandede tumorer og 2 komplekse carcinomer). Chondrocytter af blandede tumorer var negative.

VIM var positiv i suprabasale celler i de 23 tilfælde af karcinom i godartet tumor og komplekst karcinom og i bevægelige myoepiteliale celler i alle 29 tilfælde. Stromaceller var positive i alle tilfælde. Brusk var VIM-positiv i alle 7 carcinomer i godartede blandede tumorer.

Alfa-SMA-mærkede hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler i 23 carcinomer i godartede blandede tumorer og komplekse carcinomer. Spindelcellerne i 10 tilfælde (5 carcinomer i godartet blandet tumor og 5 komplekse carcinomer) viste positivitet for Alfa-SMA. I hvert tilfælde, bortset fra to komplekse carcinomer, var stellatceller negative. Stroma viste positivitet i kun 6 tilfælde (1 carcinom i godartet blandet tumor og 5 komplekse carcinomer).

P63 blev påvist i hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler af de 23 tilfælde af carcinom i godartet-blandet tumor og kompleks carcinom. Alle spindel-og stellatmotile celler var negative. Stromaceller og brusk var negative.

ER-ekspression var til stede i 11 suprabasale myoepiteliale celler (4 carcinomer i godartede blandede tumorer og 7 komplekse carcinomer); spindel-og stellatmotile celler var positive i 9 tilfælde (3 carcinomer i godartede blandede tumorer og 6 komplekse carcinomer). Brusk af blandede tumorer var negativ.

hvilende og proliferative suprabasale og spindel / stellatmotile myoepiteliale celler udtrykte ikke CK19 i nogen af de undersøgte tumorer. Brusk af blandede tumorer var også negativ for CK19.

4. Diskussion

baseret på resultaterne af Gama et al. og Tateyama et al. , fire morfologiske typer af myoepiteliale celler er til stede i brystkirtlen: hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler, der forer alveoler og kanaler og spindel-og stellat interstitielle bevægelige celler, som ligger i det interstitielle rum, hvor de kan arrangeres i reden. Myoepitheliale markører, såsom p63, CK5/6, CK14, Alpha-SMA og vim, viste sig at være værdifulde diagnostiske supplement til at lette evalueringen af komplekse og blandede proliferationer. CK19 betragtes som guldstandardmarkøren for luminalepitel og blev brugt til at undgå fejldiagnose med myoepiteliale celler. På grund af krydsreaktivitetsmønstre og det faktum, at læsionsfoci typisk er minut, havde ingen af myoepitheliale markører 100% følsomhed og specificitet for myoepitheliale celler. Som sådan skal mindst 2 markører bruges til at evaluere et givet fokus .

baseret på vores resultater var den bedste markør for suprabasale celler p63, især i forbindelse med CK14, som var begrænset til modne (basale) myoepiteliale celler og i mindre grad efterfulgt af CK5/6, Alpha-SMA og vim (Figur 1). Imidlertid markerede CK5/6 også luminale epitelceller, hvilket gjorde det vanskeligt at skelne dem fra proliferative suprabasale myoepiteliale celler . Morfologisk kan både epitel-og myoepitelceller have en polygonal form. Et kendetegn for både CK14 og CK5/6, men ikke for p63, Alpha-SMA og vim, var deres reducerede ekspression i myoepiteliale celler i suprabasal proliferativ tilstand. Ck14, CK5/6 og p63 ekspression blev gradvist tabt i celler i spindel-og stellatmotile tilstand.

Alpha-SMA og vim var til stede i spindelmotile myoepitheliale celler med forskellige intensitetsgrader. Kun vim viste sig at være en konsistent markør for stellatmotile myoepiteliale celler. I denne undersøgelse blev det stellatmotile myoepithelium arrangeret i reder og foret af hvilende celler formodentlig af alveolær Oprindelse. Denne funktion kan understøtte ideen om, at rederne af stellatmotile myoepitheliale celler, som har mistet ekspression af de vigtigste myoepitheliale suprabasale markører, men bevaret affinitet for Vim, er forstadierne til brusk, hvilket indikerer, at disse celler har afsluttet deres transformation til mesenkymale elementer. I godartede og ondartede myoepitheliale tumorer, Vim-mærkning i alle tilfælde, tab af alle andre suprabasale myoepitheliale markører, og den ringe positivitet over for CK14 i spindelceller var tegn på et fremherskende udtryk for myoepithelium-bevægelig tilstand og en mulig passage fra enkle myoepitheliale celler til mesenkymale fibroblaster.

i vores undersøgelse blev bevis for, at myoepithelialcellerne skiftede til en mesenkymal fænotype, vist ved tabet af ck14, CK5 / 6 og p63-ekspression, forstærket af den diskontinuerlige mærkning af spindelceller for Alfa-SMA, en markør for både myoepithelialceller og myofibroblaster, som var helt tabt i stellatmotile celler, der angiveligt er blevet fibroblaster.

yderligere bekræftelsesundersøgelser af Tsuda et al. rapporterede forekomsten af myofibroblaster med rester af ck14-ekspression (beskrevet som “konverterede myoepiteliale celler”). I de tilfælde, der blev undersøgt i denne undersøgelse, falmede CK14 gradvist, hvilket indikerer et tab af (myo-)epitelfænotype. Disse resultater understøtter EMT-hypotesen , der involverer en myoepithelial-lignende tilstand, som gennemgår en myoepithelial mesenkymal overgang (MMT). Denne hypotese blev bekræftet hos hunden af G Kurrtner et al. hvem sagde, at i brysttumorer involverer et af trinnene i udviklingen af mesenkymale celler udtryk for typiske myoepiteliale træk.

et interessant resultat af den foreliggende undersøgelse var positiviteten over for ER fundet i 12/29 suprabasale myoepiteliale celler og 9/29 stellatceller af carcinom i godartede blandede tumorer og komplekse carcinomer. To isoformer af ER-receptorer er blevet beskrevet, nemlig ER-kur og er-kur, hvor sidstnævnte er den eneste form udtrykt i kernerne i isolerede basal-myoepiteliale celler . Det antistof, der blev anvendt i den foreliggende undersøgelse, omfattede begge isoformer: både luminale og basale/stellatceller blev mærket, formodentlig luminale celler af er-Lutra og basal/stellatceller af ER-Lutra.

afslutningsvis blev de suprabasale myoepitheliale celler godt karakteriseret ved p63 og CK14 og i mindre grad af den anden anvendte markør. De bevægelige myoepitheliale celler er i stedet karakteriseret ved Alfa-SMA og VIM og tab af CK14, CK5/6 og p63 (figur 2). Denne undersøgelse demonstrerede også ER i både luminalepitel og suprabasal/stellat myoepiteliale celler (sidstnævnte i ca.halvdelen af tilfældene), og at ER-ekspression ikke påvirkes af den hvilende/bevægelige fase. Derfor, i serielle eller flerfarvede sektioner, immunhistokemi til er i kombination med p63 og CK14 kan tjene til at undgå fejlagtig identifikation af luminale eller myoepitheliale celler i brysttumorer hos hunde. Tendensen med bevaret Alfa-SMA og vim-ekspression i spindelceller, og kun Vim-positivitet i stellatmotile celler såvel som den nedsatte P63-ekspression i begge bevægelige typer, understøtter hypotesen om EMT, der involverer en myoepithelial-lignende tilstand i MMT. Spindelmotilcellen kunne betragtes som en tidligere transformation end stellatcellen mod en mesenkymal fænotype.

forfatteres Bidrag

disse forfattere bidrog ligeligt til dette arbejde.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

bekræftelse

forfatterne takker fru Anne Collins for redigering af den engelske tekst.

supplerende materialer