aktivering af RNase h

RNase H er et allestedsnærværende middel, der nedbryder RNA–strengen i en RNA-DNA-dupleks. Det er blevet identificeret i organismer så forskellige som vira og humane celler (Crouch og Dirksen, 1985). Mindst to klasser af RNase H er blevet identificeret i eukaryote celler. I prokaryoter (Crouch og Dirksen, 1985) er der observeret flere tegn med RNase h-aktivitet. Selvom RNase H er involveret i DNA-replikation, kan den spille andre roller i cellen og findes i cytoplasmaet såvel som kernen (Crum et al., 1988). En af de mest almindelige årsager til denne sygdom er, at det er en af de mest almindelige årsager til denne sygdom.

de præcise genkendelseselementer for RNase H er ikke kendt. Det har imidlertid vist sig, at oligonukleotider med DNA-lignende egenskaber, så korte som tetramerer, kan aktivere RNase H (Donis-Keller, 1979). Ændringer i sukker påvirker RNase h-aktivering som sukkermodifikationer, der resulterer i RNA-lignende oligonukleotider, f.eks. 2′-fluor eller 2′-metoksi ser ikke ud til at tjene som substrater for RNase H (Sproat et al., 1989; Kaasaki et al., 1993). Ændringer i orienteringen af sukkeret til basen kan også påvirke RNase h-aktivering, da relo-oligonukleotider ikke er i stand til at inducere RNase H eller kan kræve parallel udglødning (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Derudover påvirker rygradsmodifikationer oligonukleotiders evne til at aktivere RNase H. Methylphosphonater aktiverer ikke RNase H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). I modsætning hertil er fosforothioater fremragende substrater (Cacenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein og Cheng, 1993). Derudover er kimære molekyler blevet undersøgt som oligonukleotider, der binder til RNA og aktiverer RNase H (Furdon et al., 1989; Kvartin et al., 1989). For eksempel binder oligonukleotider bestående af vinger af 2′-metoksyfosfonater og et fem-basegab af deoksyoligonukleotider til deres mål-RNA og aktiverer RNase H (Furdon et al., 1989; Kvartin et al., 1989). Desuden viste et enkelt ribonukleotid i en sekvens af deoksyribonukleotider sig at være tilstrækkeligt til at tjene som et substrat for RNase H, når det er bundet til dets komplementære deoksi-oligonukleotid (Eder og Valder, 1991).

at det er muligt at drage fordel af kimære oligonukleotider designet til at aktivere RNase H og have større affinitet for deres RNA-receptorer og for at forbedre specificiteten er også blevet påvist (Giles og Tidd, 1992; Monia et al., 1993). I en undersøgelse var RNase h-medieret spaltning af måltranskript meget mere selektiv, når deoksyoligonukleotider bestående af methylphosphonatdeoksyoligonukleotidvinger og phosphodiester-huller blev sammenlignet med fulde phosphodiesteroligonukleotider (Giles and Tidd, 1992).

på trods af informationen om RNase H og demonstrationen af, at mange oligonukleotider kan aktivere RNase H i lysat-og oprensede analyser, er der endnu relativt lidt kendt om rollen af strukturelle træk i RNA-mål ved aktivering af RNase H (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; (1988). Faktisk har direkte bevis for, at RNase H-aktivering faktisk er virkningsmekanismen for oligonukleotider i celler, indtil for nylig manglet.

nylige undersøgelser i vores laboratorier giver yderligere, omend indirekte, indsigt i disse spørgsmål. ISIS 1939 er et 20 mer phosphorthioat komplementært til en sekvens i den 3′-uoversatte region af ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Det hæmmer ICAM-produktion i humane navlevene endotelceller, og nordlige blots viser, at ICAM-1 mRNA hurtigt nedbrydes. En 2 ‘ – analog af ISIS 1939 viser højere affinitet for RNA end phosphorthioatet, er stabil i celler, men hæmmer ICAM-1 proteinproduktion meget mindre potent end ISIS 1939. Det er sandsynligt, at ISIS 1939 destabiliserer RNA og aktiverer RNase H. I modsætning hertil hæmmede ISIS 1570, et 18-mer phosphorthioat, der er komplementært til translation initiation codon af ICAM-1-meddelelsen produktion af proteinet, men forårsagede ingen nedbrydning af RNA. Således havde to oligonukleotider, der er i stand til at aktivere RNase H, forskellige virkninger afhængigt af stedet i det mRNA, hvor de bundet (Chiang et al., 1991). En mere direkte demonstration af, at RNase H sandsynligvis er en nøglefaktor i aktiviteten af mange antisense-oligonukleotid, blev tilvejebragt ved undersøgelser, hvor revers-ligation PCR blev anvendt til at identificere spaltningsprodukter fra bcrabl mRNA i celler behandlet med phosphorthioat oligonukleotider (Crooke et al., 1995).i betragtning af den nye rolle af kimære oligonukleotider med modifikationer i 3′- og 5’-vingerne designet til at forbedre affiniteten for mål-RNA og nuklease stabilitet og et DNA-Type hul til at tjene som et substrat for RNase H, er undersøgelser fokuseret på at forstå virkningerne af forskellige modifikationer på effektiviteten af f.eks. I en sådan undersøgelse af E. coli RNase H, vi har rapporteret, at det viser minimal sekvensspecificitet og er processiv. Når et kimært oligonukleotid med 2 ‘- modificerede sukkerarter i vingerne blev hybridiseret til RNA, var det oprindelige spaltningssted nukleotid ved siden af det metoksi-deoksiske kryds tættest på 3’-enden af RNA-substratet. Den oprindelige spaltningshastighed steg, da størrelsen af DNA-spalten steg, og effektiviteten af det var betydeligt mindre mod et RNA-mål duplekseret med et kimært antisense-oligonukleotid end et fuldt DNA-type oligonukleotid (Crooke et al., 1995).

i efterfølgende undersøgelser har vi evalueret interaktionerne mellem antisense-oligonukleotider med strukturerede og ustrukturerede mål og virkningerne af disse interaktioner på RNase H mere detaljeret (Lima og Crooke, 1997). Ved hjælp af en række ikke-spaltelige underlag og Michaelis-Menten-analyser var vi i stand til at evaluere både binding og spaltning. Vi viste, at E. coli RNase H1 faktisk er et dobbeltstrenget RNA-bindende protein. Kd for RNA-dupleksen var 1,6 liter; Kd for en DNA-dupleks var 176 liter; og Kd for enkeltstrenget DNA var 942 liter. I modsætning hertil kunne det kun spalte RNA i en RNA-DNA-dupleks. Enhver 2 ‘- modifikation i antisense-lægemidlet på spaltningsstedet hæmmede spaltning, men signifikant ladningsreduktion og 2’-modifikationer blev tolereret på bindingsstedet. 2 ‘ – propoksyamin) i antisense-lægemidlet reduceret affinitet og spaltning. Vi har også undersøgt virkningerne af antisense oligonukleotidinducerede RNA-strukturer på aktiviteten af E. coli RNase H1 (Lima og Crooke, 1997). Enhver struktur i duplekssubstratet viste sig at have en signifikant negativ effekt på spaltningshastigheden. Yderligere, spaltning af udvalgte steder blev hæmmet fuldstændigt, og dette blev forklaret ved sterisk hindring pålagt af RNA-sløjfen, der krydser enten de mindre eller større riller eller heterodupleksen. For nylig har vi klonet og udtrykt human RNase H1. Proteinet er homologt med E. coli RNase H1, men har egenskaber svarende til dem, der er beskrevet for human RNase h type 2 (Frank et al., 1994; vu et al., 1998). Den stimuleres af lave koncentrationer af Mg2+, hæmmes af højere koncentrationer og hæmmes af Mn2+ i nærvær af Mg2+. Det er 33 kDa i molekylvægt. Det er dobbeltstrenget RNA-bindende protein og udviser unikke positions-og sekvenspræferencer for spaltning., 1999). Derudover er human RNase H2 blevet klonet, men indtil videre har det udtrykte protein ikke vist sig at være aktivt (Frank et al., 1998). For nylig har vi rapporteret om virkningerne af flere mutationer indført i human RNase H1 på aktiviteten af f.eks., 2000). Således har vi nu de nødvendige værktøjer til at begynde at udforske rollerne for human RNase H i biologiske og farmakologiske processer og begynde at udvikle lægemidler designet til at interagere med dem mere effektivt.

endelig, i det mindste med hensyn til RNase H-induceret nedbrydning af målrettet RNA, har vi for nylig vist, at niveauet af mål-RNA i området 1-150 kopier af RNA pr. Dette skyldes det faktum, at antallet af molekyler af antisense-lægemiddel pr. Andre faktorer skal således være hastighedsbegrænsende.