Aptamere er opstået som en ny kategori inden for bioreceptorer på grund af deres brede anvendelser lige fra biosensering til terapeutiske midler. Der er rapporteret om flere variationer af deres screeningsproces, kaldet SELEKS, som kan give sekvenser med de ønskede egenskaber, der er nødvendige til deres endelige anvendelse.

generering af enkeltstrenget oligonukleotidbibliotekredit

det første trin i SELEKS involverer syntesen af helt eller delvist randomiserede oligonukleotidsekvenser af en vis længde flankeret af definerede regioner, der tillader PCR-amplifikation af disse randomiserede regioner og, i tilfælde af RNA SELEKS, in vitro transkription af den randomiserede sekvens. Mens Ellington viste, at kemisk syntese er i stand til at generere ~1015 unikke sekvenser for oligonukleotidbiblioteker i deres 1990-papir om in vitro-udvælgelse, fandt de, at amplifikation af disse syntetiserede oligonukleotider førte til signifikant tab af pooldiversitet på grund af PCR-bias og defekter i syntetiserede fragmenter. Oligonukleotidpuljen forstærkes, og en tilstrækkelig mængde af det oprindelige bibliotek tilsættes til reaktionen, så der er adskillige kopier af hver enkelt sekvens for at minimere tabet af potentielle bindingssekvenser på grund af stokastiske begivenheder. Før biblioteket introduceres til mål for inkubation og selektiv retention, sekvensbiblioteket skal konverteres til enkeltstrengede oligonukleotider for at opnå strukturelle konformationer med målbindingsegenskaber.

målinkuberingredit

umiddelbart før målintroduktion opvarmes og afkøles det enkeltstrengede oligonukleotidbibliotek ofte langsomt til renaturoligonukleotider til termodynamisk stabile sekundære og tertiære strukturer. Når det er forberedt, inkuberes det randomiserede bibliotek med immobiliseret mål for at tillade binding af oligonukleotid-mål. Der er flere overvejelser for dette målinkubationstrin, herunder mål immobiliseringsmetode og strategier for efterfølgende ubundet oligonukleotidseparation, inkubationstid og temperatur, inkubationsbufferbetingelser og mål versus oligonukleotidkoncentrationer. Eksempler på mål immobiliseringsmetoder inkluderer affinitetskromatografikolonner, nitrocellulosebindende analysefiltre og paramagnetiske perler. For nylig er SELEKSREAKTIONER blevet udviklet, hvor målet er hele celler, som udvides nær fuldstændig sammenløb og inkuberes med oligonukleotidbiblioteket på kulturplader. Inkubationsbufferbetingelserne ændres baseret på det tilsigtede mål og den ønskede funktion af den valgte aptamer. For eksempel i tilfælde af negativt ladede små molekyler og proteiner anvendes høje saltbuffere til ladningsscreening for at tillade nukleotider at nærme sig målet og øge chancen for en specifik bindingshændelse. Alternativt, hvis den ønskede aptamer-funktion er in vivo-protein eller helcellebinding til potentiel terapeutisk eller diagnostisk anvendelse, inkubation bufferbetingelser svarende til in vivo plasmasaltkoncentrationer og homeostatiske temperaturer er mere tilbøjelige til at generere aptamerer, der kan binde in vivo. En anden overvejelse i inkubationsbufferbetingelser er ikke-specifikke konkurrenter. Hvis der er stor sandsynlighed for ikke-specifik oligonukleotidretention under reaktionsbetingelserne, kan ikke-specifikke konkurrenter, som er andre små molekyler eller polymerer end SELEKS-biblioteket, der har lignende fysiske egenskaber som bibliotekets oligonukleotider, bruges til at besætte disse ikke-specifikke bindingssteder. Ændring af den relative koncentration af mål-og oligonukleotider kan også påvirke egenskaberne for de valgte aptamerer. Hvis en god bindingsaffinitet for den valgte aptamer ikke er et problem, kan et overskud af mål bruges til at øge sandsynligheden for, at i det mindste nogle sekvenser binder under inkubation og bevares. Dette giver imidlertid intet selektivt tryk for høj bindingsaffinitet, hvilket kræver, at oligonukleotidbiblioteket er i overskud, så der er konkurrence mellem unikke sekvenser for tilgængelige specifikke bindingssteder.

Bindingssekvenseluering og amplifikationredit

Når oligonukleotidbiblioteket er inkuberet med mål i tilstrækkelig tid, vaskes ubundne oligonukleotider væk fra immobiliseret mål, ofte ved hjælp af inkubationsbufferen, så specifikt bundne oligonukleotider bevares. Med ubundne sekvenser skyllet væk elueres de specifikt bundne sekvenser derefter ved at skabe denatureringsbetingelser, der fremmer oligonukleotidudfoldelse eller tab af bindingskonformation inklusive strømning i deioniseret vand ved hjælp af denatureringsopløsninger indeholdende urinstof og EDTA eller ved anvendelse af høj varme og fysisk kraft. Efter eluering af bundne sekvenser, de tilbageholdte oligonukleotider reverstransskriberes til DNA i tilfælde af RNA eller modificeret basevalg, eller simpelthen indsamlet til amplifikation i tilfælde af DNA-SELEKS. Disse DNA-skabeloner fra eluerede sekvenser forstærkes derefter via PCR og konverteres til enkeltstrenget DNA, RNA eller modificerede base-oligonukleotider, som bruges som den indledende input til den næste udvælgelsesrunde.

opnåelse af ssDNAEdit

et af de mest kritiske trin i SELEKS-proceduren er opnåelse af enkeltstrenget DNA (ssDNA) efter PCR-amplifikationstrinnet. Dette vil tjene som input til den næste cyklus, så det er af afgørende betydning, at alt DNA er enkeltstrenget og så lidt som muligt går tabt. På grund af den relative enkelhed er en af de mest anvendte metoder anvendelse af biotinylerede omvendte primere i amplifikationstrinnet, hvorefter de komplementære tråde kan bindes til en harpiks efterfulgt af eluering af den anden streng med lud. En anden metode er asymmetrisk PCR, hvor forstærkningstrinnet udføres med et overskud af fremad primer og meget lidt omvendt primer, hvilket fører til produktion af mere af den ønskede streng. En ulempe ved denne metode er, at produktet skal renses fra dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og andet resterende materiale fra PCR-reaktionen. Den uønskede streng kan udføres ved at mærke denne streng ved hjælp af en fosfat-probet primer, som den genkendes af f.eks. Disse stoffer nedbryder derefter selektivt den fosfatmærkede streng, der efterlader den komplementære streng intakt. Alle disse metoder genvinder cirka 50 til 70% af DNA ‘ et. For en detaljeret sammenligning henvises til artiklen af Svobodov Kristian et al. hvor disse og andre metoder sammenlignes eksperimentelt. I klassisk SELEKS gentages processen med randomiseret enkeltstrenget biblioteksgenerering, målinkubation og bindingssekvenseluering og amplifikation beskrevet ovenfor, indtil langt størstedelen af den tilbageholdte pool består af målbindingssekvenser, skønt der er ændringer og tilføjelser til proceduren, der ofte bruges, som diskuteres nedenfor.

negativ eller modvalg

for at øge specificiteten af aptamere valgt ved en given SELEKS-procedure, et negativt valg eller modvalg, kan trin tilføjes før eller umiddelbart efter målinkubation. For at eliminere sekvenser med affinitet til mål immobiliseringsmatricekomponenter fra puljen, negativ selektion kan bruges, hvor biblioteket inkuberes med mål immobiliseringsmatricekomponenter, og ubundne sekvenser bevares. Negativ selektion kan også bruges til at eliminere sekvenser, der binder mållignende molekyler eller celler ved at inkubere oligonukleotidbiblioteket med små molekylemålanaloger, uønskede celletyper eller ikke-målproteiner og fastholde de ubundne sekvenser.

tracking selection progressionEdit

for at spore udviklingen af en SELEKSREAKTION kan antallet af målbundne molekyler, der svarer til antallet af eluerede oligonukleotider, sammenlignes med den estimerede samlede input af oligonukleotider efter eluering ved hver runde. Antallet af eluerede oligonukleotider kan estimeres gennem elueringskoncentrationsestimeringer via 260 nm bølgelængdeabsorbans eller fluorescerende mærkning af oligonukleotider. Når SELEKSREAKTIONEN nærmer sig færdiggørelsen, nærmer fraktionen af oligonukleotidbiblioteket, der binder mål, 100%, således at antallet af eluerede molekyler nærmer sig det samlede estimat for oligonukleotidinput, men kan konvergere med et lavere antal.

forbehold og overvejelseredit

nogle SELEKSREAKTIONER kan generere prober, der er afhængige af primerbindende regioner til dannelse af sekundær struktur. Der er aptamer applikationer, for hvilke en kort sekvens, og dermed primer trunkering, er ønskelig. En fremgang på den oprindelige metode gør det muligt for et RNA-Bibliotek at udelade de konstante primerregioner, hvilket kan være vanskeligt at fjerne efter udvælgelsesprocessen, fordi de stabiliserer sekundære strukturer, der er ustabile, når de dannes af den tilfældige region alene.