Extrazelluläre Matrixpräparation und Rheologie

Das ECM besteht aus einem Netzwerk aus Gelatine und Fibrin. Zur Herstellung der ECM-Komponenten wird zunächst eine 15 Gew.-%ige Gelatinelösung (Typ A, 300 ml der Fa. porcine skin, Sigma) hergestellt, indem Gelatinepulver zu einer warmen Lösung (70°C) von DPBS (1X Dulbelco’s phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium) gegeben wird. Man läßt die Gelatine durch 12 h Rühren bei 70°C vollständig auflösen und stellt dann mit 1 M NaOH den pH-Wert auf 7,5 ein. Die Lösung wird steril filtriert und bei 4 °C in Aliquots zur späteren Verwendung beim Gießen gelagert (<3 Monate). Eine Fibrinogenlösung (50 mg / ml) wird durch Auflösen von lyophilisiertem Rinderblutplasmaprotein (Millipore) bei 37 ° C in sterilen DPBS ohne Calcium und Magnesium hergestellt. Die Lösung wird bei 37 ° C ohne Rühren für mindestens 45 min gehalten, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen. Die Transglutaminase (TG) -Lösung (60 mg / ml) wird hergestellt, indem lyophilisiertes Pulver (Moo Gloo) in DPBS ohne Calcium und Magnesium gelöst und 20 Sekunden lang vorsichtig gemischt wird. Die Lösung wird dann 20 Minuten bei 37 ° C gehalten und vor der Verwendung steril filtriert. Eine CaCl2-Stammlösung (250 mM) wird durch Auflösen von CaCl2-Pulver in DPBS ohne Calcium und Magnesium (Corning) hergestellt. Zur Herstellung einer Stammlösung von Thrombin wird lyophilisiertes Thrombin (Sigma Aldrich) bei 500 U/ml unter Verwendung steriler DPBS rekonstituiert und bei -20 °C gelagert.

Für Farbrheologiemessungen wird ein geregeltes Spannungsrheometer (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) mit 40 mm Durchmesser, 2° Kegel- und Plattengeometrie verwendet. Die Scherspeicherungs- (G‘) und Verlust- (G“)-Module werden bei einer Frequenz von 1 Hz und einer Schwingungsdehnung (γ) von 0,01 gemessen. Zeitdurchläufe werden durchgeführt, indem eine vorgemischte ECM-Lösung, die Thrombin enthält, schnell auf die Peltierplatte gegeben wird, die bei 37 ° C gehalten wird.

Tintenformulierungen

Für den 3D-Bioprinting von perforierbaren PT-Modellen werden zwei Tinten benötigt. Eine Tinte, die zur Herstellung der Perfusionschipdichtung verwendet wird, besteht aus einem zweiteiligen Silikonelastomer (SE 1700, DOW Chemical) mit einem 10: 1-Verhältnis von Base zu Katalysator (nach Gewicht), das mit einem Zentrifugalmischer für 2 min homogenisiert wird (2000 U / min, AE-310, Thinky Corp, Japan). Die Silikonfarbe wird innerhalb 2 h des Mischens mit Katalysator gedruckt. Diese Tinte wird in eine Spritze (EFD Inc., East Providence, RI) und zentrifugiert, um Luftblasen vor dem Drucken bei Raumtemperatur zu entfernen. Die andere Tinte, eine flüchtige Tinte, die zum Drucken des Tubulus verwendet wird, besteht aus 38 Gew.-% Pluronic F127 (Sigma) und 100 U / ml Thrombin in entionisiertem, ultrafiltriertem (DIUF) Wasser. Die flüchtige Tinte wird durch Zugabe eines Risikoreaktorfarbstoffs zur Visualisierung in Fig. 1 und Film S1. Zur Herstellung dieser Tinte wird eine 40 Gew.-%ige Pluronic F127-Lösung in Wasser unter Verwendung eines Thinky-Mischers homogenisiert, bis das Pulver vollständig gelöst ist, und anschließend bei 4 ° C gelagert. Vor der Verwendung wird der flüchtigen (Pluronic) Tinte eine 2000 U / ml Thrombinlösung im Verhältnis 1: 20 zugesetzt und unter Verwendung eines Thinky-Mischers homogenisiert. Die flüchtige Tinte wird dann in eine Spritze (EFD Inc., East Providence, RI) bei 4°C erhitzt und zentrifugiert, um etwaige Luftblasen zu entfernen. Vor dem Drucken wird diese Tinte für mindestens 15 min bei Raumtemperatur äquilibriert.

Bioprinting von perforierbaren 3D-proximalen Tubuluskonstrukten

3D-PT-Konstrukte werden mit einem kundenspezifischen Multimaterial-3D-Bioprinter hergestellt, der mit vier unabhängig voneinander adressierbaren Druckköpfen ausgestattet ist, die auf einem 3-Achsen-, bewegungsgesteuerten Portal mit einem Bauvolumen von 725 mm × 650 mm × 125 mm montiert sind (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Die Tinten sind in separaten Spritzenkörpern untergebracht, an denen Düsen unterschiedlicher Größe (d. H. 50 µm–410 µm Durchmesser) über einen Luer-Lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Tinten werden durch Abscheidungsdüsen durch Anwendung von Luftdruck extrudiert (800 Ultra Dispensing System, EFD Inc., East Providence, RI, USA), im Bereich von 10-90 psi, entsprechend Druckgeschwindigkeiten zwischen 1 mm / s und 5 cm / s. Wir drucken zuerst die kundenspezifische Perfusionschipdichtung, indem wir die Silikontinte durch eine sich verjüngende 410 µm Düse auf 50 mm × 75 mm Glasobjektträger auftragen. Das Dichtungsdesign wird mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript erstellt, das G-Code für eine endgültige Dichtungsstruktur generiert. Nach dem Drucken wird die Perfusionschipdichtung bei 80°C in einem Ofen für >1 h ausgehärtet und vor der Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.

Die Strukturierung von 3D-PTs innerhalb des Perfusionschips erfordert eine Kombination aus Gießen des ECM und Drucken der flüchtigen Tinte. Zunächst wird die ECM-Lösung durch Kombination von 10 mg / ml Fibrinogen, 7,5 Gew.-% Gelatine, 2,5 mM CaCl2 und 0,2 Gew.-% TG hergestellt. Diese Lösung wird dann vor der Verwendung für 15-20 min bei 37 °C äquilibriert, um die optische Klarheit des ECM25 zu verbessern. Als nächstes wird die Lösung schnell mit Thrombin in einem Verhältnis von 500:1 gemischt, was zu einer endgültigen Thrombinkonzentration von 1 U / ml führt. Innerhalb von 2 min bei 37°C erfolgt die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibringel. Aus diesem Grund muss die ECM-Lösung unmittelbar nach dem Mischen mit Thrombin auf die Basis des Perfusionschips gegossen werden. Anschließend lässt man die ECM-Basisschicht unter Stickstoff leicht trocknen, so dass sie eine ebene Oberfläche bildet. Die fugitive Pluronic F127-Tinte (mit 100 U / ml Thrombin) wird in Form eines gewundenen Films (Tubulus) unter Verwendung einer sich verjüngenden 200 µm-Düse auf die Basis-ECM-Schicht gedruckt. Ein benutzerdefiniertes Python-Skript (MeCode) wird verwendet, um den Werkzeugweg in G-Code anzugeben. Direkt nach dem Drucken mit flüchtiger Tinte werden Metallhohlperfusionsstifte, die durch die Silikondichtung geschaltet sind, mit der gedruckten Tinte in Kontakt gebracht. Eine obere Schicht aus ECM wird dann gebildet, indem die ECM-Lösung über das bedruckte Röhrchen gegossen wird, wie oben beschrieben, innerhalb von 1-2 mm der Höhe der Dichtungswände. Werden Zellen wie HNDFs in das ECM eingebaut (Abb. S5) werden sie unmittelbar nach der Äquilibrierungsperiode, vor der Thrombinmischung und dem anschließenden Gießen eingemischt. Nachdem die obere ECM-Schicht gegossen wurde, wird das Konstrukt mit einem Objektträger bedeckt, um Verdunstung oder Kontamination zu verhindern, und 1 h bei 37 ° C gehalten, damit die Fibrinpolymerisation beendet und TG das Netzwerk vernetzen kann. Das Konstrukt wird dann für 15-20 min auf 4 ° C abgekühlt, um die gedruckte flüchtige Tinte zu verflüssigen, die mit kalten Zellmedien aus dem Gerät gespült wird, wobei offene Leitungen zurückbleiben, die als das gewünschte röhrenförmige Netzwerk dienen, das in das ECM mit oder ohne Zellen im extratubulären ECM-Raum eingebettet ist.

Mit dieser Methode haben wir auch 3D-Architekturen in einer schichtweisen Build-Sequenz erstellt. Beispielsweise kann jede einzelne Schicht des in Fig. S10 wurde unter Verwendung eines modifizierten Druckprotokolls konstruiert, das die zuvor diskutierten Materialien und Methoden enthält. Nach dem Drucken der ersten Tubuli mit flüchtiger Tinte wird eine Schicht ECM über den Druck gegossen und 20 min bei 37 ° C gelieren gelassen, bevor die nächste proximale Tubulusschicht mit flüchtiger Tinte auf die kürzlich gelierte Schicht gedruckt wird. Diese sukzessive Konstruktion führt eine 3D-Geometrie ein und ermöglicht eine erfolgreiche Evakuierung aller Kanäle unabhängig nach der Konstruktion. Wässrige Risk-Reaktor-Farbstoffe werden durch die Kanäle perfundiert und zur Visualisierung mit UV-Licht angeregt.

Um den 3D-Tissue-Chip-Montageprozess abzuschließen, wird jedes PT-Konstrukt auf eine bearbeitete Edelstahlbasis gelegt und ein dicker Acryldeckel darauf gelegt. Der Deckel und die Basis werden zusammen durch vier Schrauben festgeklemmt und bilden eine Dichtung um die gedruckte Silikondichtung. Als nächstes wird ein steriler peristaltischer Schlauch mit zwei Anschlägen (PharMed BPT, 0,25 mm Innendurchmesser) mit Medien gefüllt und mit dem Auslass eines Sterilfilters verbunden, der an einem 10-ml-Spritzenzylinder (EFD Nordson) befestigt ist, der als Medienreservoir dient. PTEC-Medien (entwickelt für Wachstum, also ATCC-Formulierung plus 1% FBS, 1% Aprotinin und 1% Anti-Anti), die für >3 h in einem Inkubator bei 37 ° C äquilibriert wurden, 5% CO2 wird in das Medienreservoir gegeben und der Schlauch aus dem Reservoir wird mit dem Auslass des Chips verbunden (Metallhohlperfusionsstift). Eine Spritze wird dann benutzt, um geringfügigen Druck auf die Medien im Fass auszuüben und zwingt sie, den befestigten Schläuche einzutragen und vollständig zu füllen. Das Befüllen des Schlauchs mit Medien vor dem Anschluss an den Kreislauf verhindert das Einbringen von Luftblasen in das System. Um den Perfusionskreislauf zu vervollständigen, wird ein Silikonschlauch aus dem Reservoir mit dem Einlassmetallperfusionsstift auf dem Chip verbunden. Am Einlass und Auslass des Perfusionschips sind Schlauchklemmen angebracht, um einen unkontrollierten Fluss zu verhindern, wenn er von der Peristaltikpumpe getrennt wird, der das Epithel beschädigen oder Luftblasen in das System eindringen lassen kann. Das Medienreservoir wird durch einen Sterilfilter auf dem Medienreservoir jederzeit an die atmosphärischen Bedingungen im Inkubator angepasst.

Zellkultur

Human immortalisierte PTECs (RPTEC/TERT1, ATCC CRL-4031) werden gemäß den Anweisungen von ATCC kultiviert und für alle PT-Modellstudien bis Passage 20 verwendet. Für die Genexpressionsanalyse werden humane primäre RPTEC (Cell Science), immortalisierte PTECs (RPTEC-TERT1, Evercyte) und A498 (ATCC HTB-44) Nierenkrebszellen verwendet und gemäß den Anweisungen des Lieferanten kultiviert. Humane neonatale dermale Fibroblasten (HNDF), GFP-exprimierende (Angio-Proteomie) werden gemäß den Anweisungen des Lieferanten kultiviert und bis zur Passage 15 verwendet.

Genexpressionsanalyse

Humane primäre RPTEC (Cell Science), immortalisierte RPTEC-TERT1 (Evercyte) und A498 (ATCC HTB-44) Nierenkrebszellen werden gemäß den Anweisungen des Lieferanten in 96-Well-Platten gezüchtet und am Tag 3 nach der Konfluenz durch Ersetzen des Kulturmediums durch 100 µl / well 1x RNA-Lysemischung (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101) gesammelt. Anschließend werden 40 µl Lysat mit einem mRNA-Capture Magnetic Bead Set (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, Katalognummer 312631) gemischt, über Nacht inkubiert, zur verzweigten DNA-Amplifikation aufbereitet und nach Herstellerangaben analysiert (Panomics QuantiGene Plex Assay Kit, QP1015). Die PPIB-Sonde wird als Housekeeping-Gen zur Normalisierung verwendet. Fluoreszenzintensitätsdaten (FI) werden als Durchschnitt und Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten dargestellt.

Zytokinanalyse von Medienperfusat

Medienperfusat wird über einen Zeitraum von 25 Tagen nach der Zellsaat aus einem Röhrchen entnommen und vor der Analyse bei -80 ° C gelagert. Für die Zytokinprofilierung werden die Überstände auf Eis aufgetaut, 2x in Probenverdünnungspuffer (BioRad catalog #M60-009RDPD) verdünnt und mittels Luminex-Technologie-basiertem ELISA unter Verwendung des Bio-Plex Pro ™ Human Chemokine IL-6 (Set #171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) und MCP-1 (Set #171-BK36MR2) und des Bio-Plex 200 Systeme (BioRad) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Daten werden als durchschnittliche Zytokinkonzentrationen und Standardabweichungen technischer Triplikate angegeben.

Epithelisierung und Longitudinalkultur

Jedes 3D-PT-Konstrukt wird vor der Zellbeladung/-aussaat mehrere Stunden mit PTEC-Medien im Inkubator perfundiert. PTECs (PTEC / TERT1, ATCC) werden aus ihrer Kulturschale trypsinisiert und in Medien auf ~ 2 × 107 Zellen / ml konzentriert. Die Zellsuspension wird dann durch den Auslass in den Perfusionschip geladen (Fig. S3b, c). Das beladene Konstrukt wird für mehrere Stunden seitlich in den Inkubator gelegt und im Verlauf mehrerer halbstündiger Intervalle um 180 ° gedreht, um eine gleichmäßige Aussaat der Tubuluswände zu ermöglichen, und dann über Nacht ohne Strömung im Tubulus inkubiert. Am nächsten Tag werden nicht adhärente Zellen unter Schwerkraftfluss aus dem Tubulus gespült. Dann wird mit der Perfusion frischer Medien begonnen, und die verbleibenden Zellen beginnen sich zu gruppieren und wachsen dann aus diesen Kolonien (Abb. S3f), bis sie etwa 3 Wochen nach der Aussaat Konfluenz erreichen (Abb. S3k). Während der Wachstumsphase werden PTECs mit PTEC-Medien gefüttert, die gemäß den ATCC-Richtlinien hergestellt wurden, plus 1% Aprotinin (EMD Millipore, verwendet, um den Abbau des ECM zu verlangsamen), 1% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum-Antimykotikum (Gibco). Nach der Reifung wird FBS entfernt und PTECs packen in eine enge epitheliale Monoschicht (Film S2). Am Tag 1 nach der Aussaat werden die PTECs einem kontinuierlichen, unidirektionalen Fluss mit 1 µl / min ausgesetzt, was Scherspannungen entspricht, die je nach Tubulusquerschnitt zwischen 0,1 und 0,5 Dyn / cm2 variieren. Das Medium wird über eine Schlauchpumpe in einem geschlossenen Kreislauf zugeführt und alle 2 Tage gewechselt.

Studie zur Albuminaufnahme

Die Albuminaufnahme wird sowohl für die gedruckten 3D-PT-Modelle als auch für die 2D-Kontrollen bewertet. Die erste Kontrolle besteht aus PTECs, die auf Gewebekulturplastik gezüchtet wurden, während die zweite Kontrolle aus PTECs besteht, die auf unserem ECM gezüchtet wurden. In jedem Fall werden PTECs zur Konfluenz gezüchtet und in serumfreien Medien reifen gelassen. Mit FITC konjugiertes Humanserumalbumin (HSA-FITC, Abcam ab8030) wird in PTEC-Medien mit 50 µg / ml suspendiert. Alle Proben werden mit HSA-FITC in ihren Medien für 2 h inkubiert (im Falle der Perfusion wird es durch das offene Lumen perfundiert). Nach der Belichtung werden alle Proben mit 3x Volumen gewaschen und dann mit 10x Trypsin trypsinisiert, um die einzelnen Zellen zu sammeln. Die Zellen werden fixiert und mit primären und sekundären Antikörpern gegen Megalin gegengefärbt (Tabelle S2 listet die verwendeten spezifischen Antikörper auf). Zellen aus diesen Proben und nackte Zellen werden durchflusszytometrisch analysiert (BD LSR Fortessa) und Daten werden von n = 10.000 Zellen pro Probe gesammelt. Um Bilder von HSA-FITC und Megalin in PTECs zu erhalten, werden die Proben mit Formalin fixiert, anstatt nach dem Waschschritt trysinisiert zu werden. Diese Proben werden für Megalin gegengefärbt und mit konfokaler Mikroskopie (Zeiss LSM710) abgebildet.

Cyclosporin-A-Test

Die Wirkung von CysA auf 2D-Kontrollen und bioprintierte 3D-PTs wird untersucht. In 2D werden Zellen in einem 96-Well-Format auf Gewebekulturplastik ausgesät und bis zur Konfluenz gezüchtet. Sie werden gemäß den ATCC-Richtlinien gefüttert. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) wird in ihren Medien in verschiedenen Konzentrationen suspendiert und mit Zellen für 24 h inkubiert. Ein Lebensfähigkeitstest unter Verwendung von (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) in Gegenwart von Phenazinmethosulfat (MTS) wird bei der 24 h-Marke nach der Exposition durchgeführt. Dieser Test wird an PTECs bei früher Konfluenz abgeschlossen, indem den Zellen am Tag, an dem sie die Konfluenz erreichten, CysA verabreicht wird, sowie bei später Konfluenz, indem CysA einige Tage nach Erreichen der Konfluenz verabreicht wird. Bemerkenswerterweise sind die Toxizitätsergebnisse für jeden Fall ähnlich (Abb. 5n). Bei 3D-PTs wird CysA in verschiedenen Konzentrationen durch das offene Lumen reifer Tubuli nach Erreichen der Konfluenz (bei ~ 3 Wochen) verabreicht Marke), wo für mindestens 10 Tage kein Serum in den Medien enthalten ist. An der 24-Stunden-Marke nach CysA-Exposition wird ein FITC-Dextran-Dichtheitstest (unten beschrieben) durchgeführt, um Störungen der Barrierefunktion von PTECs zu bewerten und zu quantifizieren. Direkt im Anschluss wird der PT mit 10%igem gepuffertem Formalin 1 h fixiert und auf Aktin und DAPI gegengefärbt (Tabelle S2 listet die spezifisch verwendeten Färbungen auf).

Diffusionspermeabilitätsmessungen

Zur Beurteilung der Barrierefunktion des Epithels in 3D wird die Diffusionspermeabilität quantifiziert, indem PTEC-Medien im offenen Lumen mit 25 µg / ml FITC-konjugiertem 70 kDa Dextran (FITC-Dex, Sigma-Produkt 46945) mit einer Rate von 15 µL / min für 3 min und 1 µl / min danach für ~ 30-45 min. Der gesamte Test wird unter Live Cell Imaging durchgeführt, wobei sowohl der Tubulus als auch das umgebende ECM im Sichtfeld liegen (Abb. S9). Das Diffusionsmuster von FITC-Dex wird mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiovert 40 CFL) nachgewiesen. Fluoreszenzbilder werden vor der Perfusion und alle 3 bis 5 Minuten über einen Zeitraum von 30 bis 45 Minuten aufgenommen. Die Diffusionsdurchlässigkeit von FITC-Dex wird berechnet, indem Änderungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit unter Verwendung der folgenden Gleichung quantifiziert34;

Pd ist der Diffusionsdurchlässigkeitskoeffizient, I1 ist die durchschnittliche Intensität zu einem Anfangszeitpunkt, I2 ist eine durchschnittliche Intensität bei t ~ 30-45 min, Ib ist die Hintergrundintensität (Bild vor der Perfusion von FITC-Dex), und d ist der Durchmesser des Kanals. Andere Forscher haben berichtet, dass PTECs Dextran39 resorbieren können, was zu etwas höheren Werten für die gemessene Diffusionsdurchlässigkeit führen würde.

Wir untersuchten auch die Barriereeigenschaften unserer epithelial ausgekleideten Tubuli mit einer niedermolekularen Verbindung, Inulin (4,5 kDa), die weder resorbiert noch in vivo von PTECs mit der gleichen oben beschriebenen Methode sezerniert wird. Insbesondere wird Inulin-FITC (Sigma-Produkt F3272) in erwärmten PTEC-Medien bei 100 µg / ml gelöst und im offenen Lumen mit einer Rate von 20 µl / min für 3 min und 1,5 µl / min danach für ~ 15 min perfundiert. Der gesamte Test wird unter Live Cell Imaging durchgeführt, wobei sowohl der Tubulus als auch das umgebende ECM im Sichtfeld liegen (Abb. S7). Das Diffusionsmuster von FITC-Inulin wird mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (Leica) nachgewiesen. Fluoreszenzbilder werden vor der Perfusion und alle 3 bis 5 Minuten mit einer geschlossenen Lichtquelle und einem bewegungsgesteuerten Stadium aufgenommen über den Zeitraum von 15 Minuten, um technische Dreifachmessungen zu sammeln.

Elektronenmikroskopie

Für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) werden PTECs in 2D- oder 3D-Architekturen oder gesundes menschliches Nierengewebe, das aus einer Standardbiopsie vor der Transplantation gewonnen wurde, unter Verwendung von 2,5% Glutaraldehyd, 1,25% Paraformaldehyd und 0,03% Pikrinsäure in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) für mindestens mehrere Stunden fixiert. Kleine Proben (1 mm × 1 mm) werden entnommen und in 0,1 M Cacodylatpuffer gewaschen und in 1% Osmiumtetroxid (OsO4) (EMS) und 1 gebadet.5% Kaliumferrocyanid (KFeCN6) (Sigma) für 1 h, 3x in Wasser gewaschen und 1 h in 1% igem wässrigem Uranylacetat (EMS) inkubiert, gefolgt von 2 Wäschen in Wasser und anschließender Dehydratisierung in verschiedenen Alkoholsorten (jeweils 10 min; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Die Proben werden dann für 1 h in Propylenoxid (EMS) gegeben und über Nacht in einer 1:1 Mischung aus Propylenoxid und TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kanada). Am folgenden Tag werden die Proben in TAAB Epon eingebettet und 48 h bei 60°C polymerisiert. Ultradünne Schnitte (ca.60 nm) werden auf einem Reichert Ultracut-S Mikrotom geschnitten, auf mit Bleicitrat gefärbte Kupfergitter gelegt und in einem JEOL 1200EX Transmissionselektronenmikroskop untersucht und mit einer AMT 2k CCD Kamera aufgenommen. Die Bildanalyse wird mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) werden perfundierte PTECs in 3D mit 10% gepuffertem Formalin für 1 h fixiert. Die Proben werden dünn geschnitten (~ 1 mm dick), um Zellen freizulegen, die das offene Lumen umschreiben. Das Fixiermittel wird mit PBSx2 und anschließender Dehydratisierung in unterschiedlichen Ethanolqualitäten (je 20 min) abgewaschen; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Die Proben werden dann für 30 min in 50% Ethanol und 50% Hexamethyldisilazan (HMDS) gegeben, gefolgt von 100% HMDS 3 ×30 min. Alle Schritte werden in einem geschlossenen und versiegelten Glasbehälter durchgeführt. Nach dem abschließenden Waschen mit HMDS werden die Proben entnommen und in einem offenen Behälter unter N2 in der Abzugshaube getrocknet. Getrocknete Proben werden mit leitfähigem Kohlenstoffband auf Aluminiumstifthalterungen montiert, mit Gold sputterbeschichtet und mit einem Tescan Vega SEM abgebildet.

Immunfärbung

Immunfärbung mit anschließender konfokaler Mikroskopie wird verwendet, um die zelluläre Lokalisation von Proteinen in 2D- und 3D-PTEC-Modellen zu beurteilen. Vor der Immunfärbung wird jedes Konstrukt mit PBS gewaschen und anschließend für 20 min bis 1 h mit 10% gepuffertem Formalin fixiert. Das Fixiermittel wird mit mehreren Wäschen in PBS für mehrere Stunden entfernt und dann über Nacht mit 1 Gew.-% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert. Primärantikörper gegen das interessierende Zellprotein oder Biomarker werden mit den Konstrukten für 1 Tag in den in Tabelle S2 aufgeführten Verdünnungen in einer Lösung von 0,5 Gew.-% BSA und 0,125 Gew.-% Triton X-100 inkubiert. Die Entfernung ungebundener Primärantikörper erfolgt durch einen Waschschritt gegen eine Lösung von PBS oder 0,5 Gew.-% BSA und 0,125 Gew.-% Triton X-100 in PBS für 1 Tag. Sekundärantikörper werden mit den Konstrukten für 1 Tag in den in Tabelle S2 aufgeführten Verdünnungen in einer Lösung von 0,5 Gew.-% BSA und 0,125 Gew.-% Triton X-100 in PBS inkubiert. Die Proben werden 2 h lang mit NucBlue oder ActinGreen gegengefärbt und dann vor der Bildgebung 1 Tag lang in PBS gewaschen.

Bildwiedergabe und -analyse

Die Phasenkontraktmikroskopie wird mit einem invertierten Leica DM IL Scope mit Objektiven von 1,25X bis 40X durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie wird mit einem aufrechten Zeiss LSM 710 mit Wassertauchobjektiven von 5X bis 40X unter Verwendung von Spektrallasern bei 405, 488, 514, 561 und 633 nm Wellenlängen durchgeführt. Bildrekonstruktionen von Z-Stacks werden in ImageJ unter Verwendung der Z-Projektionsfunktion mit der Einstellung maximale Pixelintensität durchgeführt. Alle Helligkeitssteigerungen werden gleichmäßig über ein gesamtes z-projiziertes Bild durchgeführt. 3D-Bildrekonstruktionen und rotierende Filme (Movie S3) werden mit der Imaris-Software durchgeführt. Das neue CytoSMART (Lonza) Incubator-System wird zur Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen (Movie S2) verwendet. Die Bildanalyse zur Quantifizierung der Diffusionsdurchlässigkeit wird unter Verwendung benutzerdefinierter MATLAB-Skripte unter Verwendung zuvor gemeldeter Methoden34 durchgeführt. Die TEM-Bildanalyse wird mit der ImageJ-Software durchgeführt, um die Zellhöhe (n ≥ 50), die Mikrovilli-Dichte (n ≥ 25) und die Mikrovilli-Länge (n ≥ 150) über mindestens 3 unabhängige Proben für jede Bedingung zu messen.

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Analyse wird unter Verwendung von MATLAB durchgeführt und die statistische Signifikanz wird bei einem Wert von p < 0,05 bestimmt, wie durch eine ANOVA unter Verwendung des Tukey-Vergleichstests für mehrere Paare bestimmt. Verschiedene Signifikanzniveaus (p-Werte) sind mit Sternchen gekennzeichnet und in jeder Figurenlegende sind spezifische p-Werte angegeben.