Ergebnisse

Wir untersuchten Wildtyp- (WT), heterozygote V2RV31R / WT- und homozygote V2R31R /V2R31R-Mäuse. Die mutierten Mäuse hatten in jedem Entwicklungsstadium eine normale Anzahl und Häufigkeit reifer αβ-T-Milzzellen und Thymozyten. Aufgrund des Mangels an kongenischen Markern können TCRß-Proteine weder durch das Allel identifiziert werden, das sie codiert, noch ob sie Cß1-versus Cß2-Regionen enthalten. Daher führten wir eine Durchflusszytometrie mit Anti-V2- und Anti-V31-Antikörpern durch, um Zellen zu quantifizieren, die V2 + – und V31 + -TCRß-Proteine exprimieren. Wir untersuchten CD4 + – und CD8 + -einzelpositive (SP) Thymozyten, da es sich um reife und naive αβ-T-Zellen handelt. Unter Berücksichtigung der veröffentlichten Daten (8, 9) konnten wir einen kleinen Anteil (0,11%) von Zellen nachweisen, die mit beiden Antikörpern in WT-Mäusen gefärbt waren (Abb. 1B und C), was mit einer kleinen Population von V2+V31+ αβ-T-Zellen übereinstimmt. Wir beobachteten einen 12,4-fach erhöhten Anteil dieser Zellen in V2R31R / WT-Mäusen und einen 32,8-fach erhöhten Anteil in V2R31R / V2R31R-Mäusen (Abb. 1 B und C). Diese erhöhten Frequenzen von Dual-TCRß + -Zellen korrespondierten mit den größeren Nutzungen von V2 und V31 in exprimierten TCRß-Ketten (Abb. 1 D-F). Diese Daten zeigen, dass die Verbesserung der Qualität von zwei Vßs auf demselben Allel ihre Umlagerung und folglich den Anteil von T-Zellen erhöht, die zwei verschiedene Arten von TCRß-Proteinen exprimieren. Da das Vß-Repertoire von SP-Thymozyten die relativen Niveaus widerspiegelt, die einzelne Vß-Segmente rekombinieren (10), zeigt die bevorzugte Verwendung von V31 gegenüber V2, dass V31R V2R für die Umlagerung übertrifft. Dies könnte auf eine bessere Zugänglichkeit von V31 (11) oder eine Wechselwirkung von V31 mit Dß–Jß–Segmenten zurückzuführen sein, bevor die Kontraktion des TCRß-Locus V2 in die Nähe von Dß-Jß-Segmenten bringt. Bemerkenswerterweise impliziert der mehr als zweifache Anstieg dieser Dual-TCRß + -Zellen in V2R31R / V2R31R-Mäusen im Vergleich zu V2R31R / WT-Mäusen, dass zwei verschiedene V (D) Jß-Umlagerungen zur TCRß-Expression desselben Allels beitragen können.Um festzustellen, ob ein einzelnes TCRß-Allel tatsächlich die Expression von TCRß-Proteinen aus zwei verschiedenen V (D)Jß-Umlagerungen unterstützen kann, analysierten wir Mäuse, bei denen ein TCRß-Allel durch Deletion des TCRß-Enhancers (Eß) inaktiviert wird (12, 13). Wir untersuchten Mäuse, die das Eß-deletierte Allel gegenüber einem WT-Allel, einem Allel mit RSS-Ersatz von entweder V2 (V2R) oder V31 (V31R) oder beiden (8) trugen. Wir haben einen kleinen Prozentsatz (0,094%) von V2 + V31 + SP-Thymozyten in WT / EβΔ-Mäusen nachgewiesen (Abb. 2A und B), die möglicherweise eine seltene Population von Zellen darstellen, die zwei verschiedene TCRß-Proteine aus demselben WT-Allel exprimieren. Unabhängig davon beobachteten wir V2 + V31 + -Zellen mit einer 1,9-fach höheren Frequenz in V2R / EβΔ-Mäusen und mit einer 4,8-fach höheren Frequenz in V31R / EβΔ-Mäusen (Abb. 2A und B). Somit erhöht die Verbesserung der Qualität beider Vß + den Anteil der Zellen, die sowohl V2 + – als auch V31 + -TCRß-Proteine exprimieren. Bemerkenswert ist, dass wir eine 14,4-fach erhöhte Häufigkeit von V2 + V31 + -Zellen in V2RV31R / EβΔ-Mäusen im Vergleich zu WT / EβΔ-Mäusen nachweisen konnten (Abb. 2A und B), was darauf hinweist, dass die Verbesserung der Qualität von zwei Vß-RSSs synergistisch den Prozentsatz der Zellen erhöht, die sowohl V2 + – als auch V31 + -TCRß-Proteine exprimieren. Tatsächlich löscht man einen Teil des V31-RSS auf dem V2R-Allel (das V2R31Δ-Allel; Abb. 2C) reduziert die Häufigkeit von V2 + V31 + -Zellen dramatisch auf Werte, die denen von V2R / EβΔ-Mäusen entsprechen oder darunter liegen (0,178% gegenüber 0,135%; Abb. 2A und B). Zusammenfassend bestätigen diese Daten, dass das V2R31R-Allel die Expression von zwei verschiedenen TCRß-Proteinen aus zwei verschiedenen V (D) Jß-Umlagerungen auf einem einzelnen Allel fördert.

Unsere Studie zeigt, dass ein intrinsischer genetischer Mechanismus die monogene TCRß-Assemblierung und -expression steuert. Wir zeigen, dass minderwertige Vß-RSSs kooperieren, um die Assemblierung und Expression von zwei verschiedenen TCRß-Genen aus einem Allel zu begrenzen. Wir haben zuvor gezeigt, dass Vß-RSSS von schlechter Qualität die Vß-Rekombinationsfrequenz vor der Rückkopplungshemmung stochastisch zurückhalten, um die biallelische Assemblierung und Expression von TCRß-Genen zu verringern (8). Wir schließen nun weiter, dass Vß-RSSS von geringer Qualität auch die Inzidenz senken, dass sowohl V31 als auch ein Upstream-Vß auf demselben Allel rekombinieren. Diese Umlagerungen könnten entweder 1) eine deletionale V2–Umlagerung in den Dß1–Jß1–Cß1–Cluster und eine Inversions–V31–Umlagerung in den Dß2–Jß2–Cß2–Cluster oder 2) eine Inversions–V31-Umlagerung in den Dß1-Jß1-Cß1-Cluster umfassen, die einen Teil des Locus invertiert, der den Dß2-Jß2-Cß2-Cluster enthält, und dann eine Inversions-V2-Umlagerung in den Jß2-Cß2-Cluster (7) (Abb. 2D). Um eine monogene TCRß-Assemblierung und -expression zu erreichen, könnte dieser RSS-basierte genetische Mechanismus mit epigenetischen Prozessen funktionieren, die mit der Durchsetzung der monoallelischen Vß-Rekombination in Verbindung gebracht wurden. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, dass dynamische Wechselwirkungen von Vß-Segmenten mit der Kernlamina die Vß–Rekombinationseffizienz durch Unterdrückung der Vß-Chromatinzugänglichkeit und des Chromosomenschleifens zwischen Dß-Jß-Clustern und stromaufwärts gelegenen Vß-Segmenten senken (14, 15). In diesem Zusammenhang könnten Vß-RSSS von schlechter Qualität die Wahrscheinlichkeit verringern, dass zwei Vß-Umlagerungen auf einem Allel auftreten, wenn V31 und ein vorgelagertes Vß–Segment beide zugänglich sind und das vorgelagerte Vß in der Nähe von Dß-Jß-Segmenten geschleift wird. Daher können die Eigenschaften von RSSs der monogenen Assemblierung und Expression von Säugetier-TCRy-, TCRδ- und Igλ-Proteinen in Säugetieren und Ig-Proteinen in Knorpelfischen zugrunde liegen. Zusätzlich kann V RSSs in ähnlicher Weise zum isotypischen Igk- und Igg-Ausschluss in B-Zellen beitragen.