Studienteilnehmer, klinische Proben und HLA-Genotypisierung. Alle Probanden mit einer Vorgeschichte von Bluttransfusionen wurden von der Studie ausgeschlossen. Zweiunddreißig Familien mit einer Vorgeschichte von Simplex-Sklerodermie wurden rekrutiert und auf HLA-Klasse-II- und Klasse-I-Allele untersucht; 3 Generationen wurden für 20 Familien und 2 Generationen für 12 Familien untersucht. Für den Studieneintritt aller Frauen mit Kindern waren drei Generationen erforderlich, und die Teilnahme aller Kinder war erforderlich, da der Mikrochimerismus in diesen Fächern von der Mutter oder von einem Kind herrühren konnte. Die Teilnahme von Männern, Kindern und nie schwangeren Frauen umfasste 2 Generationen (d. H. Das Subjekt und die Mutter). Ein Sklerodermie-Patient war ein Zwilling; Der nicht betroffene Zwilling wurde ebenfalls für die Studie rekrutiert. Dreiunddreißig gesunde Kontrollfamilien wurden rekrutiert, darunter 22 mit 3 Generationen und 11 mit 2 Generationen. Die HLA-Genotypisierung wurde für insgesamt 254 Personen abgeschlossen: 128 in Sklerodermie Familien und 126 in Kontrollen. Einige zusätzliche Familienmitglieder wurden aufgenommen, um die Zuordnung des HLA-Haplotyps zu bestätigen. Aus dieser Datenbank wurden Probanden für weitere Studien ausgewählt, wenn die Mutter des Probanden ein nicht geteiltes HLA-Allel hatte, auf das HLA-spezifische Assays abzielten. Alle Probanden erhielten eine Einverständniserklärung, die vom Institutional Review Board des Fred Hutchinson Cancer Research Center genehmigt wurde.

PBMCs wurden aus heparinisiertem Vollblut durch Verdünnung in HBSS isoliert, gefolgt von Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) Gradientenzentrifugation bei 1,077 g/ ml. Bei einigen Kindern wurde DNA aus Haarwurzeln für die HLA-Typisierung extrahiert, wie zuvor beschrieben (9). Genomische DNA wurde aus PBMCs mit einem Isoquick Nucleic Extraction Kit (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), nach Herstellerangaben und resuspendiert in 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). DNA-Menge und Reinheit wurden durch standardspektrophotometrische Methoden bestimmt. Bei einigen Probanden wurde DNA direkt aus Vollblutproben extrahiert.Die DNA-basierte Typisierung mit sequenzspezifischen Oligonukleotid-Sondenpanels wurde verwendet, um spezifische Allele an den Loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 und DQB1 zu identifizieren. Für DRB1 detektiert ein anfänglicher Assay mit niedriger Auflösung DRB1 von DBR1 * 01 bis DRB1 * 14 und es folgen 1 oder mehr hochauflösende Assays, die spezifische DRB1-Allele identifizieren, wie zuvor beschrieben (10, 11). DQA1- und DQB1-Allele wurden unter Verwendung ähnlicher Methoden wie zuvor beschrieben bestimmt (9), wobei zusätzliche Sonden hinzugefügt wurden, um neu identifizierte Allele nachzuweisen (12). HLA-Klasse-I-Antigene wurden unter Verwendung eines Standard-Lymphozytotoxizitätstests bestimmt, der 20 HLA-A-, 30 HLA-B- und 8 HLA-Cw-Antigene unterscheidet. Einige Proben wurden einer Sequenzierung unterzogen, um spezifische HLA-Klasse-I-Allele zu bestimmen (13). Um die HLA-Allel- und Antigenzuweisungen sowie die Homozygotie zu bestätigen, wurden mehrere Familienmitglieder genotypisiert — einschließlich Väter und Geschwister von Probanden, sofern verfügbar.

HLA-spezifische PCR-Primer. Primersequenzen wurden basierend auf allen bekannten Allelsequenzen entworfen (12). Die Primersynthese erfolgte durch Oligos etc. (Wilsonville, Oregon, USA). Ein Primer-Set wurde entwickelt, um einen HLA-Klasse-I-Polymorphismus und 3 gezielte HLA-Klasse-II-Polymorphismen anzuvisieren. Um HLA-B44 anzugreifen, wurde ein Primer entwickelt, der eine Gruppe von HLA-B-Allelen basierend auf Polymorphismen an den Positionen 66, 69 und 75 von Exon 3 und eine andere Gruppe von HLA-B-Allelen basierend auf einem Polymorphismus an Position 229 von Exon 3 amplifiziert. Die Kombination von Primern amplifiziert spezifisch HLA-B44-Allele und erzeugt ein 190-bp-Fragment. Alle DRB-spezifischen Primer wurden entwickelt, um Allelgruppen basierend auf Sequenzpolymorphismen in der hypervariablen Region von Exon 2 zu amplifizieren. Für HLA-DRB5 * 01 amplifiziert ein Primer eine Gruppe von DRB5 * 01-Allelen basierend auf Polymorphismen an den Positionen 25, 26, 31, 32 und 38 und der andere amplifiziert eine Gruppe von DRB5 * 01-Allelen basierend auf Polymorphismen zwischen den Positionen 215 und 231. Die Kombination von Primern amplifiziert spezifisch HLA-DRB5 * 01-Allele und erzeugt ein 210-bp-Fragment. Für HLA-DRB1 *04 amplifiziert ein Primer eine Gruppe von DRB1 * 04-Allelen basierend auf Polymorphismen an den Positionen 25, 26, 31 und 36 und der andere amplifiziert eine Gruppe von DRB1 * 04-Allelen basierend auf Polymorphismen an den Positionen 97 und 110. Die Kombination von Primern amplifiziert spezifisch DRB1 * 04 und erzeugt ein 104-bp-Fragment. Eine weitere Unterscheidung zwischen DRB1 * 04-Allelen wurde erreicht, indem der erstere Primer zusammen mit 1 von 2 Primern verwendet wurde, die einen Dimorphismus an Position 258 (Codon 86) unterscheiden, wodurch ein 263-bp-Fragment erzeugt wurde. Für HLA-DRB1 * 11 amplifiziert ein Primer eine Gruppe von DRB1 * 11-Allelen basierend auf Polymorphismen an Positionen 25, 26, 28, 30, 31, 32, und 35 von Exon 2, und der zweite Primer amplifiziert eine Gruppe von DRB1*11-Allelen basierend auf Polymorphismen an den Positionen 173 und 174 von Exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR–Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 µL durchgeführt, das 1,25-1,5 µg genomische DNA, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001 Gew.-%/vol Gelatine, 260 µmol/L jedes Desoxynukleotids, 0,5 U Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA), 2,5 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) und 20 pmol jedes HLA-spezifischen Primers. Zur Herstellung des Endvolumens von 50 µL wurde Reinstwasser zugegeben. Die Amplifikation bestand aus 5 Minuten bei 96 ° C, 35 Zyklen bei 95 ° C für 35 Sekunden und bei 65 ° C für 35 Sekunden für HLA-B44 (58,5 ° C für DRB5 * 01; 72 ° C für DRB1 * 04; 64,5 ° C für DRB1 * 11), dann 72 ° C für 1 Minute, mit einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 ° C für 10 Minuten. Optimale Amplifikation, Sensitivität und Spezifität wurden durch Titration von MgCl2 und Primerkonzentrationen, Anzahl der Thermozyklen und Glühtemperatur erreicht. Alle Amplifikationen wurden in einem GeneAmp System 9600 Thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems) durchgeführt. Die Assay-Sensitivität wurde durch Spiking-Experimente bestimmt, bei denen die Ziel-DNA seriell verdünnt und zu einer festen Menge Hintergrund-DNA hinzugefügt wurde, die den Allelen des Subjekts entsprach. Die HLA-B44- und DRB5*01-spezifischen PCR-Assays konnten mindestens 1 Zielzelle in einem Hintergrund von 500.000 Zellen nachweisen; die HLA-DRB1*04– und DRB1*11-spezifischen PCR-Assays konnten mindestens 1 Zielzelle in einem Hintergrund von 100.000 Zellen nachweisen. Jeder PCR-Assay umfasste die folgenden Kontrollen: (a) eine positive Kontrolle der DNA aus einer Zelllinie mit dem interessierenden HLA-Allel (0,2-0,5 µg); (b) eine Positivkontrolle von der Mutter des Probanden (0,2–0,5 µg); (c) Negativkontrollen von DNA aus einer Zelllinie mit denselben HLA-Allelen wie das Subjekt (1,25 µg und 0,35 µg); und (d) eine Negativkontrolle bestehend aus allen PCR-Reagenzien ohne DNA. PCR-Produkte wurden bei 100 V konstanter Spannung für 1 Stunde in 6% oder 8% vorgefertigten TBE-Gelen unter Verwendung einer Novex Xcell II Minizelle (Novex, San Diego, Kalifornien, USA) elektrophoresiert. Jedes Gel enthielt positive und negative PCR-Kontrollen und eine 100-bp-Leiter (SLL-100; Gensura, Del Mar, Kalifornien, USA). Gele wurden mit Silberfleck (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornien, USA) und mit dem DryEase Gel Drying System (Novex) getrocknet. Aus Vollblut extrahierte DNA wurde in 4 Proben unzureichender Menge getestet, um PBMCs zu isolieren. Alle Tests wurden doppelt durchgeführt, und die meisten Proben wurden mehr als einmal getestet.

PCR-Vorsichtsmaßnahmen. Es wurde äußerste Vorsicht walten lassen, um eine mögliche PCR-Kontamination zu vermeiden und nachzuweisen. Separate Bereiche wurden für die PBMC-Trennung verwendet, Extraktion genomischer DNA, PCR-Setup und Amplifikation, und Analyse von PCR-Produkten, mit Vorher-Nachher-PCR-Tests in separaten Labors durchgeführt. Aerosolbeständige Pipettenspitzen (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Kalifornien, USA) wurden in allen Experimenten verwendet, und mehrere Negativkontrollen wurden in alle PCR-Amplifikationen eingeschlossen.

Sequenzierung von HLA-spezifischen PCR-Produkten. Sieben Mikroliter des anfänglichen HLA-spezifischen PCR-Produkts wurden zusätzlichen 40 Amplifikationszyklen unter Verwendung der ursprünglichen Thermocycling-Parameter unterzogen. Dreißig Mikroliter dieses PCR-Produktes wurden in einem 1,75%igen Reinst-Agarosegel (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) elektrophoresiert und mit einer Lösung von Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) angefärbt. Die Bande wurde exzidiert, eluiert und mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornien, USA). Das gereinigte PCR-Produkt wurde in 30 µL 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0) eluiert und 100 ng zu einer Reaktionsmischung mit 8,0 µL Sequenzierungsreagenz-Vormischung (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12, gegeben.5 pmol 5′ oder 3′ Primer und 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Reinstwasser wurde zugegeben, um ein Endvolumen von 20 µL zu erhalten. Die Sequenzierungsreaktionsgemische wurden in einem Thermocycler GeneAmp System 9600 3 Minuten auf 96 ° C erhitzt, gefolgt von 25 Zyklen bei 96 ° C für 10 Sekunden, 50 ° C für 5 Sekunden und 60 ° C für 4 Minuten. Erhaltene PCR-Produkte wurden wie oben säulengereinigt und elektrophoresiert. Sense- und Antisense-Sequenzen wurden für die HLA-spezifischen PCR-Produkte des Probanden und der Mutter sowie für positive Kontrollzelllinien-PCR-Produkte doppelt bestimmt. Die Sequenzanalyse wurde mit der Software Wisconsin Package Version 9.1 der Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA) durchgeführt.

Cytospin-Objektträgerpräparation und In-situ-Hybridisierung. Cytospin-Objektträgerpräparate wurden auf das Vorhandensein von X– und Y-chromosomenspezifischen Sequenzen unter Verwendung einer im Molecular Cytogenetics Laboratory des Fred Hutchinson Cancer Research Center entwickelten Technik zur quantitativen Analyse des Chimärismus in geschlechtswidrigen Stammzelltransplantationspaaren analysiert (14). Cytospin-Proben männlicher Zellen wurden durch Zentrifugation von 30.000–60.000 frisch abgetrennten PBMCs auf Objektträger, 300 µL pro Objektträger, hergestellt. Objektträger wurden bis zur Verwendung in einer Trocknungskammer gelagert. Die X–chromosomenspezifische Sonde DXZ1 (15) wurde mit Digoxigenin und die Y-chromosomenspezifische Sonde DYZ1 (16) mit Biotin nick–translatiert. Die XY-Sondenmischung hatte eine Endkonzentration von 0,5 µg/ml jeder Sonde in Hybridisierungspuffer aus 50% Formamid, 2× SSC (0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat) und 10% Dextransulfat. Es wurde 5 Minuten bei 72°C denaturiert, auf Eis abgekühlt und auf den Objektträger aufgebracht. Objektträger wurden in Pepsin verdaut (0,1 mg/ml in 0.01 M HCl) bei 37°C für 3 Minuten, fixiert in 4% gepuffertem Formalin für 15 Minuten, gespült in PBS, dehydratisiert in Ethanol (70%, 95% und 100%) und luftgetrocknet. Objektträger wurden durch Behandlung in 2 × SSC (72 ° C) für 10 Minuten, 70% Formamid, 2 × SSC (72 ° C) für 3 Minuten denaturiert, in einer Ethanolserie (-20 ° C) dehydratisiert und luftgetrocknet. Zehn Mikroliter Sonde wurden auf den Objektträger aufgebracht und dann unter einem mit Gummizement versiegelten Deckglas (22 × 22 mm) montiert. Es wurde über Nacht bei 42°C in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Objektträger wurden in 55% igem Formamid, 2× SSC (45°C) für 15 Minuten und 2× SSC (Raumtemperatur) für 5 Minuten gewaschen. Sondensignale wurden gleichzeitig mit Fluorescein-gekoppeltem Anti-Digoxigenin (1:500 Verdünnung; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) und Texas red–gekoppeltem Avidin (1:500 Verdünnung; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien, USA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln nachgewiesen. Nach dem Waschen mit 2× SSC und PBS wurden sie mit VECTASHIELD (Vector Laboratories) montiert. Die Objektträger wurden direkt mit einem Epifluoreszenzmikroskop Nikon E600 mit einer 100-W-Quecksilberlampe ausgewertet, die mit geeigneten Einzel-, Doppel- und Dreifach-Bandpassfiltern ausgestattet war. Es wurden nur Zellen mit 2 sichtbaren Chromosomensignalen aufgezählt, ohne eine elektronische Verbesserung zu verwenden.